非还原性糖类生成酶及其制备和应用制造技术

公开了一种新的非还原性糖类生成酶及其制备和应用。这种酶可从Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　　Ｓｐ．Ｍ－１１（ＦＥＲＭＢＰ４１３０）和Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　　Ｓｐ．Ｑ３６（ＦＥＲＭ　　ＢＰ－４３１６）等微生物的培养物中获取，当其作用于还原性淀粉部分水解产物时可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。当葡萄糖淀粉酶和α－葡糖苷酶作用于这种非还原性糖类时，易于产生海藻糖。这种非还原性糖类和海藻糖可广泛应用于食品、化妆品和药品中。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
非还原性糖类生成酶及其制备和应用本专利技术涉及一种新的非还原性糖类生成酶，以及它的制备和应用。更具体地说，涉及这样一种新的还原性糖类生成酶:当其作用于一种或多种具有3个或3个以上的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物时，生成一种具有海藻糖结构的非还原性糖类，还涉及这种酶的制备，以及能够产生这种酶的微生物。本专利技术还涉及含有可由这种酶制备的以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类的组合物，含有上述非还原性糖类的还原性比较低的糖类，和/或由这种糖类所制备的海藻糖。海藻糖或α，α-海藻糖长期以来一直被认为是由葡萄糖单元组成的非还原性糖类。正如在 Advance in Carbohydrate Chemistry, 18 卷，第 201-225 (1963)中(由美国的 Academic Press 出版)和在 Appliedand Environmental Microbiology,第 56 卷，3213-3215页(1990)中所公开的,海藻糖广泛存在于微生物、蘑燕和昆虫中，但含量较低。由于非还原性糖类包括不会与具有氨基的物质，如氨基酸和蛋白质反应的海藻糖，所以它们即不会引起氨基-羰基反应，也不会改变含有氨基酸的物质。因此，非还原性糖类被认为可以使用而不用担心会引起不理想的褐变和变质。因为上述原因，就迫切需要建立一种制备这种还原糖的方法。在海藻糖的传统制备方法中，和在日本专利公开号N0.154, 485, 75中所公开的，采用的微生物，或者如日本专利公开号N0.216，695/83中提出的，同时采用麦芽糖酶-和麦芽糖磷酸化酶将麦芽糖转化成海藻糖。然而，前一种方法不适于工业规模的制备，因为海藻糖在作为原材料的微生物中的含量以干固体物计(d.s.b.)低于15w/w% (“w/w%”的表达形式在说明书中可简化为％，除非另有说明)，且分离和提纯步骤复杂。而后一种方案具有如下缺点:(i)因为海藻糖是通过葡萄糖-1-磷酸生成的，作为底物的麦芽糖不能以较高的浓度使用；(ii)因为磷酸化酶促反应体系是可逆反应，所以目的产物海藻糖的产量较低；(iii)要保持该反应体系的稳定和顺利延续其酶促反应实际上是困难的。关于海藻糖的制备，在“Food Chemicals”，N0.88，67-72页(1992年8月)上题为“Current Status of Starch Application Developmentand Related Problems，，的章节中的标题为“Oligosaccharides”的专栏中有报道:“尽管海藻糖具有广泛的用途，但是通过直接糖转移反应或水解反应的酶促制备海藻糖的方法在本领域被认为从科学上来讲是不可能的。”因此，以淀粉为材料酶促制备海藻糖的方法被认为从科学上讲是极为困难的。业已知道，由淀粉材料，如液化淀粉、环状糊精和麦芽寡糖制备的淀粉的部分水解产物通常以还原性末端基团为末端单元。在说明书中，这种淀粉的部分水解产物被称为“非还原性的淀粉部分水解产物”。这种还原性淀粉部分水解产物的还原能力通常表达为以其干固体物重计的“葡萄糖当量(DE)值”。 业已知道，还原性淀粉部分水解产物中那些具有较高的DE值的产物通常具有较低的分子量和粘度，以及较高的适宜甜度和反应性，且易与含有氣基的物质如氣基酸和蛋白质反应，使其品质发生不理想的揭变、发臭和变质。还原性淀粉部分水解产物的这些不利特性根据其DE值有所变化，且还原性淀粉部分水解产物与其DE值之间的关系是极为重要的。甚至在本领域中一直认为要打破这种关系是不可能的。打破这种关系的唯一途径是一种在较高的氢压下通过氢化还原性淀粉部分水解产物将其还原性末端基团转化成羟基而将这种水解产物制成非还原性糖类。不过，这种方法需要高压灭菌锅并耗费大量的氢和能源，而且还需要较高的水平的控制或安全设施以免发生灾难。还原性部分淀粉水解产物与所得产物不同，因为前者由葡萄糖单元组成，而后者，即所得淀粉部分产物的糖醇则是由葡萄糖和山梨醇组成，当将其用在人体上时可能导致出现消化紊乱或腹泻症状。因此，迫切需要建立一种降低甚至消除还原性淀粉部分水解产物的还原能力而又不改变以葡萄糖单元作为其组分糖的状况的方法。本专利技术的目的是要提供一种新的非还原性糖类及其应用，并由还原性淀粉部分水解产物来制备，以使打破传统上认为的还原性部分淀粉部分水解产物和其DE值之间的关系，并揭示这种非还原性糖类的新用途。为达上述目的，本专利技术人广泛筛选了能产生一种新的非还原性糖类生成酶的微生物，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时，可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。结果，从日本冈山市和Soja市的土壤中分别分离出了根瘤菌属(Rhizobium)的新微生物，命名为“Rhizobium Sp.M-1I”,和节杆菌属(Arthrobacter)的新微生物,命名为iiArthrobacter Sp.Q36” ；并发现上述微生物能产生非还原性糖生成酶，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时，能生成具有海藻糖结构的非还原性糖类，而且当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时容易制备出所需要的非还原性糖类。我们还发现，通过先将这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物再将所得非还原性糖类用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶处理可很容易地制备出海藻糖。这样，本专利技术人完成了这一专利技术。此外，我们还从常规微生物中广泛筛选了能产生这种酶的微生物。结果发现，短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微珠菌属(Micrococcus)、弯曲杆菌(Curtobac`terium)和土杆菌属(Terrabacter)的微生物与根瘤菌属和节杆菌属的微生物一样能产生这种非还原性糖类生成酶，并且我们完成了这一专利技术。另外，我们建立了制备含有这种非还原性糖类及含非还原性糖类的还原性较低的糖类和/或由这种糖类制成的海藻糖的组合物如食品、化妆品和药品的制品方法，而且我们完成了这一专利技术。本专利技术所涉及的微生物Rhizobium sp.Μ-11以及Arthrobacter sp.Q36分别于1994年6月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，武汉大学内)，其保藏号分别为 CCTCC M94031 和 CCTCC M94030。图1表示温度对由根瘤菌属的Rhizobium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。图2表示pH值对由根瘤菌属的Rhizobium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。图3表示由Rhizibium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的热稳定性。图4表示由Rhizibium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的pH稳定性。图5表示温度对由节杆菌属的Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。图6表示pH值对由Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。图7表示由Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的热稳定性。图8表示由Arthrobacter SP.Q36获得的非还原性糖类生成酶的pH稳定性。本专利技术涉及一种新的非还原性糖类生成酶，以及它的制备和应用。本专利技术还涉及能够产生这种本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备如下式所示非还原性糖类或者含有该非还原性糖类的糖组合物的方法，　　　　Ｇｎ－Ｔ　　　　其中，符号“Ｇ”表示葡萄糖残基；“ｎ”为一个或多个整数；“Ｔ”表示α，α－海藻糖，　　　　该方法包括步骤：　　　　（ａ）将淀粉物质部分水解，获得含有直链淀粉和／或麦芽寡糖的还原性淀粉部分水解产物；　　　　（ｂ）将能够形成如上式所示非还原性糖类的酶作用于步骤（ａ）中所述还原性淀粉部分水解产物，以形成所述非还原性糖类或者含有该非还原性糖类的糖组合物；和　　　　（ｃ）收集所得到的非还原性糖类或者含有该非还原性糖类的糖组合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：丸田和彥，久保田伦夫，杉本利行，三宅俊雄，
申请(专利权)人：株式会社林原生物化学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]