本发明专利技术公开了一种细胞悬浮培养和贴壁培养的无血清培养基及其制备方法，它是以牛血清白蛋白粉末、胰岛素粉末、过氧化氢酶粉末、亚硒酸钠粉末及二巯基乙醇溶液等为原料，通过一定工艺制备而成适于细胞悬浮培养的无血清培养基。并此基础上添加细胞纤维连结蛋白而制成适于贴壁培养的无血清培养基，并还加工有用于预铺培养瓶底的促贴壁因子。因此本发明专利技术是在排除血清干扰的情况下使细胞维持正常生长，从而使实验结果更加科学和准确，并有较好的重复性。它还有如下特点：（１）配方中加有过氧化氢酶、亚硒酸钠和二巯基乙醇，前两者有抗氧化作用，后者可促进淋巴细胞的生长；（２）有两种剂型；（３）适用于多种类型的组织和细胞的生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学实验用品，尤其是涉及一种用于在体外培养人和动物组织和细胞的。
技术介绍
在医学实验中，人和动物的组织和细胞在体外培养时除需要富含氨基酸、无机盐、维生素、脂类物质和能量物质(如糖类)的基础培养基外，还需要能提供其它营养、细胞因子和激素的动物血清。传统的细胞和组织培养都要使用5-20％的动物血清，但由于动物血清的成份十分复杂，至今尚未完全弄清其中的成份，例如在血清中含有500多种蛋白质，其中有些蛋白质的功能还不完全清楚。因而在医学科学实验中，常因加入的血清差异而导致实验结果产生一些差异，不易达到标准化，影响实验结果的重复性和准确性。如某些研究多肽因子作用的实验，因血清中含有浓度不定的多肽细胞因子、激素或其它物质，它们可能影响细胞的生长、免疫识别、特异性多肽因子和细胞表面受体的功能等。另外血清中还存在抑制因子，以及抗原和抗体，它们可干扰体外免疫实验结果。国外早在1979年就开始进行了无血清培养法的研究。现国外生产的无血清培养基种类很多，分别适用于昆虫细胞、杂交瘤细胞、皮肤角朊细胞、造血细胞、肿瘤细胞、神经细胞、肝细胞、内皮细胞、胚胎干细胞的无血清培养基，它们共同存在下述缺点(1)仅适用于某一特定组织类型的细胞，如神经细胞、肝细胞、角朊细胞、内皮细胞、胚胎干细胞；(2)除少数特定无血清培养基分别用于贴壁培养外，尚无一种细胞贴壁无血清培养基适用于多种类型细胞的贴壁培养。如国外可用于细胞贴壁培养的无血清培养基有皮肤角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte-SerumFree Media，Keratinocyte-SFM)、巨噬细胞无血清培养基(Macrophage-SFM)、内皮细胞无血清培养基(Endothelial-SFM)。申请人于2002年12月17日申请了一项专利技术专利“一种无血清培养基与浓缩液及其制备方法”(申请号02157709.9)，该专利技术专利中的牛血清白蛋白溶液、胰岛素溶液、纯化人转铁蛋白溶液、胆固醇溶液、过氧化氢酶溶液等五种成份的主要原料均呈粉末状，可以称量，不含多肽因子和激素物质，因而既可避免因血清批号不同所带来的不稳定性，又不致于影响实验结果。该专利技术专利的无血清培养基是在排除血清干扰的情况下使细胞维持正常生长，从而使实验结果更加科学和准确，并有较好的重复性，适用于多种类型的组织和细胞的生长。但其缺点是不适合进行细胞贴壁细胞培养。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适用于较多种类型的组织和细胞的，它能在排除血清干扰的情况下使细胞维持正常生长，从而使实验结果更加科学和准确，并有较好的重复性。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术的无血清培养基的配方包括以终浓度计的牛血清白蛋白溶液5-10mg/ml、胰岛素溶液8-20μg/ml、纯化人转铁蛋白溶液1-30μg/ml、胆固醇溶液20-60μg/ml和过氧化氢酶溶液20-60μg/ml，其特征在于还包括亚硒酸钠溶液17.3-34.6μg/ml和二巯基乙醇溶液(1％)0.35-0.70ml。该无血清培养基适于细胞悬浮培养。在本专利技术的适于细胞悬浮培养的无血清培养基中还可加入以终浓度计的细胞纤维连结蛋白25-50μg/ml和促贴壁因子(PAF)。它适于细胞贴壁培养。本专利技术的适于细胞悬浮培养的无血清培养基的制备方法为(1)、按常规方法配制浓度分别为50-100mg/ml的牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin，缩写BSA)溶液、80-400μg/ml的胰岛素(Insulin，缩写Ins)溶液、10-300μg/ml的纯化人转铁蛋白(Human Transferrin，缩写TF)溶液、200-600μg/ml的胆固醇(Cholesterol，缩写Chol)溶液和200-600μg/ml的过氧化氢酶(Catalase，缩写Cat)溶液，均溶于伊斯科夫改良刀比科氏培养基；(2)、亚硒酸钠(Sodium Selenite，缩写SS)溶液的配制将市售的1.73mg亚硒酸钠粉末，溶于10ml三蒸馏水中，滤过除菌，4℃冰箱保存；(3)、二巯基乙醇(2-mercaptoethanol，缩写2-ME)溶液的配制将市售的二巯基乙醇加入三蒸馏水中，使成1％溶液，为贮存液，滤过除菌，置4℃冰箱保存；(4)、将上述七种溶液按配方浓度混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s media，缩写IMDM)稀释为500ml/瓶，即得细胞悬浮培养无血清培养基(Suspension-Serum Free Media，SP-SFM)。本专利技术的适于细胞贴壁培养无血清墙养基的制备方法为(1)、按常规方法配制浓度分别为50-100mg/ml的牛血清白蛋白溶液、80-400μg/ml的胰岛素溶液、10-300μg/ml的纯化人转铁蛋白溶液、200-600μg/ml的胆固醇溶液和200-600μg/ml的过氧化氢酶溶液，均溶于伊斯科夫改良刀比科氏培养基；(2)、亚硒酸钠溶液的配制将市售的亚硒酸钠粉末1.73mg溶于10ml三蒸馏水中，滤过除菌，4℃冰箱保存；(3)、二巯基乙醇溶液的配制将市售的二巯基乙醇加入三蒸馏水中，使成1％溶液，为贮存液，滤过除菌，置4℃冰箱保存；(4)、细胞纤维连结蛋白溶液的配制①、人骨髓成纤维细胞培养上清液用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypague)密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，以1×106细胞/ml浓度培养于预先铺有4％多聚赖氨酸的塑料培养瓶中，加10％人AB血清和10-6M氢化可的松(终浓度)，培养5天，形成贴壁单层，吸去上清，换细胞悬浮培养无血清培养基继续培养2天，收获上清液，作进一步纯化；②、将1公升人骨髓成纤维细胞培养上清液加1ml牛血清白蛋白处理的明胶-琼脂糖(Sepharose)4℃孵育24小时，用离心沉淀方法分离已结合细胞纤维连结蛋白的明胶-琼脂糖(Agarosc)珠，将10ml珠灌装于1.5cm直径的层析柱；该柱在室温下用4倍柱床容量的0.15M NaCl，10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH7.0洗涤，用缓冲液C，pH11.0洗提；确定蛋白峰，将含细胞纤维连结蛋白的各部分混合，用缓冲液A(0.15M NaCl，1mM CaCl2，10mM环己胺丙烷磺酸，重调pH至11.0)透析，检测蛋白质浓度，使成0.125g/ml浓度，储存于-70℃；(5)、将上述八种溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基稀释成500ml/瓶，即得细胞贴壁培养无血清培养基(Adhesion-SerumFree Media，AD-SFM)；(6)、促贴壁因子的配制①、人骨髓成纤维细胞培养上清液用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，以1×106细胞/ml浓度培养于预先铺有4％多聚赖氨酸的塑料培养瓶中，加10％人AB血清和10-6M氢化可的松(终浓度)，培养5天，形成贴壁单层，吸去上清，换细胞悬浮培养无血清培养基继续培养2天，收获上清液，作进一步纯化；②、玻璃珠亲和层析将玻璃微珠用0.6M NaHCO3(pH8.0)洗涤，装柱(5cm×50cm)，用0.6M NaHCO3平衡过夜，流速100ml/小时。人骨髓成纤维细胞培养上清液用0.1N NaOH调节本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞悬浮培养和贴壁培养的无血清培养基，配方包括以终浓度计的牛血清白蛋白溶液：５－１０ｍｇ／ｍｌ、胰岛素溶液：８－２０μｇ／ｍｌ、纯化人转铁蛋白溶液：１－３０μｇ／ｍｌ、胆固醇溶液：２０－６０μｇ／ｍｌ和过氧化氢酶溶液：２０－５０μｇ／ｍｌ，其特征在于：还包括亚硒酸钠溶液：１７．３－３５．０μｇ／ｍｌ和１％二巯基乙醇溶液：０．３５－１．０ｍｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴育成，
申请(专利权)人：戴育成，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]
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