一种高效的聚乙二醇活化工艺制造技术

一种聚乙二醇（ＰＥＧ）末端羟基的高效活化工艺，其特征在于：（１）利用水和甲苯在１４０℃共沸的性质将ＰＥＧ溶解在甲苯中，然后加热到１４０℃共沸除去ＰＥＧ中的水份（ＰＥＧ水份含量＜５０ｐｐｍ）；（２）无水ＰＥＧ和２－氟－１－甲基吡啶鎓甲苯－４－磺酸盐在无水的极性有机溶剂（水份含量＜５０ｐｐｍ）中进行反应；（３）反应过程中滴加叔胺或者吡啶等有机碱维持溶液的ｐＨ在８～９之间；（４）利用乙醚沉淀的方法分离ＰＥＧ活化产物；利用异丙醇重结晶的方法纯化ＰＥＧ活化产物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质化学领域，特别涉及蛋白质修饰剂及其制备方法和用途。
技术介绍
聚乙二醇(PEG)化学修饰蛋白质作为一种提高蛋白质在医药和生物
应用的方法，正引起人们越来越多的关注。经过适当的化学修饰，蛋白质的很多特征会发生变化，同时有效地保持其主要的生物功能，如酶活性或受体识别能力。通过PEG修饰可掩饰蛋白质的表面并增加其分子体积，从而降低被肾小球过滤的几率；还可防止抗体、抗原、酶等的靠近，减少被蛋白酶类的降解。PEG还可将自身的理化性质赋予蛋白质，例如改变蛋白质的生物体内的分布及溶解性，实现蛋白质药物的靶向给药。许多实验已证明，蛋白质经PEG修饰后免疫原性与抗原性大大降低。例如经PEG修饰的牛血清蛋白(BSA)不与BSA抗血清发生沉淀，经PEG修饰的BSA免疫血清既不与BSA反应，也不与经PEG修饰的BSA反应，可见BSA丧失了免疫原性和抗原性。蛋白质经PEG修饰后其循环半衰期也有不同程度提高，如超氧化物歧化酶(SOD)经PEG化后，在体内的半衰期(T1/2)从0.667h延长到5.09h。另外，经PEG共价修饰后蛋白质的稳定性也往往有不同程度的提高，许多不溶性药物经PEG修饰后给药更为容易。目前，至少有2种PEG修饰的蛋白药物(PEG-L-天冬酰胺酶，PEG-腺苷脱氨酶)由FDA批准上市，有5种以上处于临床实验阶段。据不完全统计，有27种酶处于研究阶段。可见，PEG化学修饰技术是生化药物研究开发的重要手段，如果与基因重组技术相结合，将有更好的发展前景。另外，由于PEG可改变蛋白质的可溶性、生物相容性、药代动力学等性质，在应用生物
也具有很大潜力。例如，在有机相中不可溶的酶经PEG修饰后变为可溶且酶活性得到保留，这对生物催化及制药技术的发展具有重大意义。PEG简介PEG是一种线性的或分支的中性聚合物，溶于水及其他很多有机溶剂，其分子式为HO-(CH2CH2O)n-CHCH2OH；用于蛋白质修饰的聚乙二醇多为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，分子式为HO-(CH2CH2O)n-CHCH2O-CH3。mPEG分子只有一个羟基用于偶联反应，另一端的羟基被甲基化，避免了偶联反应中蛋白质分子的相互交联。PEG化学修饰蛋白质在生物技术及生物医药领域引起人们很大兴趣有以下几个原因(1)PEG没有毒性，已经被FDA批准用于体内服用。(2)静脉注射到人体内的游离PEG很容易通过肾排出。(3)PEG的免疫原性很小。(4)在蛋白质适当的部位共价偶联上PEG后，活性不会完全丧失，某些蛋白质还有活性升高的情况。并且能消除一些异体蛋白质的免疫原性，能延长蛋白质药物在体内的半衰期。(5)水溶液中PEG存在的条件下它能有效地排除其它聚合物，这一性质已经应用到双水相萃取的研究中。PEG与蛋白质偶联后，PEG可以稳定被修饰的蛋白质分子；降低或消除蛋白质的免疫原性及提高耐受性；降低蛋白质被肾脏清除的速率；提高蛋白质对细胞膜的穿透力；改善药物动力学。PEG活化技术单甲氧基聚乙二醇的一端羟基被甲基封闭，可以避免蛋白质的交联；另一端的羟基化学反应活性较低，只能在较激烈的条件下直接与其它基团反应，而这样的条件常为蛋白质所不能耐受。因此需要用一定的方法改造PEG的末端羟基，即连接特定的活泼基团之后才能在温和的条件下，以较高的反应速率与蛋白质相偶联。这便是PEG的活化技术(activation)。PEG修饰的位点可以是蛋白质表面的氨基，也可以是巯基或其它特殊基团，但大多数是修饰氨基。因为蛋白质分子表面的游离氨基，具有较高的亲核反应活性，使之成为蛋白质化学修饰中最常用的被修饰基团。几种用于偶联蛋白质分子的mPEG的常用的活化方法在文献以及专利中都有报道。下图列出了常用的PEG活化方法，即mPEG的活性中间体的制备。mPEG的活性中间体含有能和蛋白质分子上的氨基或其它活性基团相反应的功能基团，与蛋白质分子的反应条件必须足够温和，以维持蛋白质的天然构象。同时，为达到此目的，应使用以水为溶剂的缓冲液以及接近中性的pH值。 在DAVIS及其最初合作者的研究工作中，三聚尿氰(1、2)和PEG上的醇羟基反应，以使三聚尿氰(或称三氯均嗪)环上的卤原子只有一个被取代，其它的卤原子可和蛋白质分子上的氨基反应(三氯均嗪，第一个Cl在4℃就可以反应，第二个在25℃，第三个在80℃才反应)。这一方法已被很多研究者所采用及改进，至今仍是最常用的方法之一。虽然这种活化只需一步即可完成，但因三卤均嗪衍生物的毒性以及过强的反应活性而使反应速度难以控制，因而使其应用受到限制。事实上，尿嗪卤化物被认为是蛋白质修饰最不合适的试剂。用其修饰的蛋白质常伴随生物活性的较大损失。用N-羟基琥珀酰亚胺与其它化学试剂(3～8)联合对PEG活化的方法和修饰产物，实施可行性好、活性高，是近年来常被采用的方法和修饰剂，但这些修饰剂存在着容易水解、储存性能不稳定的缺点，而且对某些蛋白质反应活性过高，不利于控制修饰度和修饰位点。1986年That T.Ngo在US4,582,875中公开了一种用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐(2-Fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate)活化固体载体聚合物羟基的方法，如多糖介质等。该试剂也可以用于PEG或mPEG羟基的活化。用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐活化的PEG或mPEG与前述方法的活化产物相比具有抗水解能力强的优点，因此特别适合于在水性溶液中对多肽或者蛋白质等生物活性分子进行活化修饰。但是That T.Ngo提供的活化方法并不特别适合于PEG或mPEG的活化，主要因为(1)该专利所公开的工艺是针对不溶于活化用溶剂的固体载体，而PEG或mPEG溶解于活化用溶剂，因此，包括原料处理、活化条件、产物分离、产物纯化等工艺将不同；(2)用于生物活性分子化学修饰的活化PEG或mPEG都有很高的要求，例如活化产物的活化率要高(＞95％)，活化产物的纯度要高(＞99％)等等。但是，很可惜用That T.Ngo提供的活化方法得到的活化PEG或mPEG并不能满足这些要求，因为它们的活化度较低(＜30％)，产物的纯度较低(＜75％)。用这样的活化PEG或mPEG对蛋白质进行化学修饰显然是不理想的，因为活化率低势必要用很高浓度的修饰剂，而修饰剂浓度过高对蛋白质的生物活性保护是不利的；修饰剂纯度低的话其含有的一些杂质也会对蛋白质的生物活性造成伤害。为此，本专利技术提供一种高效的聚乙二醇(PEG)末端羟基的活化工艺及其活化产物在蛋白质修饰中的应用。其特征是(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性质将PEG溶解在甲苯中，然后加热到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)无水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐在无水的极性有机溶剂(水份含量＜50ppm)中进行反应，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反应过程中滴加叔胺或者吡啶等有机碱维持溶液pH在8～9之间。(4)利用乙醚沉淀的方法分离PEG活化产物；利用异丙醇重结晶的方法纯化PEG活化产物。(5)纯净的PEG活化产物在缓冲水溶液中与蛋白质等带有亲核基团的生物活性分子反应，得到PEG与该分子的偶联物。本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏志国，马光辉，贠强，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：