制备纯化的甲型肝炎病毒体和疫苗制剂的方法技术

本发明专利技术提供了从感染的细胞培养物的上清液中纯化甲型肝炎病毒以及制备纯化的ＨＡＶ抗原制剂的方法。本发明专利技术也涉及一种包含一种制剂的ＨＡＶ疫苗组合物，其中所述的制剂含有一定量的足以在哺乳动物中诱导保护性免疫应答的纯化的成熟ＨＡＶ粒子。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从感染的细胞培养物的上清液中纯化甲型肝炎病毒以及制备纯化的HAV抗原制剂的方法。本专利技术也涉及一种包含一种制剂的HAV疫苗组合物，其中该制剂含有充分量的在哺乳动物中诱导保护性免疫应答的纯化的成熟HAV粒子。
技术介绍
甲型肝炎不断地引起散发性的、地方性的以及偶发性的死亡，并且是一个全球性的公共卫生问题。所述感染是由微小RNA病毒家族的一个成员-甲型肝炎病毒(HAV)所引起的，其中的微小RNA病毒是一组小的非包膜的RNA病毒。所述病毒体的直径为27-32nm，由从单个多肽前体分子裂解得到的VP1，VP2和VP3三个多肽组成。甲型肝炎病毒(HAV)是唯一的嗜肝性病毒，其可分离自细胞培养物，但所述病毒通常难以增殖，具有长的潜伏期且没有细胞致病作用。尽管一些灵长类动物细胞类型已经被报道能够支持HAV的复制，诸如胎恒河猴肾脏细胞系(FRhk-4)、初级的非洲绿猴肾脏细胞(AGKM)、连续的非洲绿猴肾脏细胞(BCS-1)，但这些细胞通常不能用于人的疫苗，因为猴子的肾脏往往具有高含量的潜伏的猴病毒，其在用于病毒生产疫苗的过程中可变为可见的。其它的细胞系不能被使用是因为一些细胞的致肿瘤特性引起对其用于疫苗生产的抑制。用于繁殖HAV的初级人上皮细胞、成纤维细胞或肾脏细胞或细胞株的批量生产因这些细胞在培养物中的低传代数而受到限制。事实上，世界卫生组织(WHO)的应用指南表明仅仅少数的一些细胞系被允许用于病毒疫苗的生产。一种目前被接受并被证实适用于生产人疫苗的细胞系是VERO细胞。VERO细胞是已被许可用于人疫苗制备工艺的持续猴肾脏细胞，并且现在被用于脊髓灰质炎和狂犬病疫苗的生产。人们已经尝试使用VERO细胞来生产HAV，但在VERO细胞上复制HAV是受限制的，因为VERO细胞具有病毒生长的温度限制且从未在被感染细胞的上清液中发现病毒(Locarnini等，1981，J.Virol.37216-225)。US4783407公开了在滚瓶中在不高于33℃的温度下在VERO细胞上生产HAV来克服温度限制。在此系统中，冻融培养细胞后，每摇瓶可获得大约50μg的HAV抗原。目前尚没有描述基于在VERO细胞上增殖HAV的商用疫苗。迄今为止，福尔马林灭活的HAV疫苗已被生产出来用于临床试验(Andre等，1990，在Melnick(ed)Prog.Med.Virol.Basel，Karger 3772-95，Armstrong等，1993，J.Hepatology 1820-26)且四种疫苗已被许可，它们能诱导持久的免疫力并保护抵抗初次感染。目前有效的灭活HAV全病毒疫苗的生产方法利用人胚胎的肺成纤维细胞系MRC-5作为宿主细胞，其在组织培养物中生长缓慢且仅仅添加胎牛血清。在细胞培养物中使用血清和/或在培养基中添加来自动物或人来源的蛋白添加剂带来的问题，即不同批次的不同特性和组成以及被支原体、病毒或BSE-因子污染的风险所带来的问题，是众所周知的。因此，人们进行许多尝试来提供有效的宿主系统和不需要血清或其它来自血清的化合物的培养条件。此外，由于含有病毒抗原的原材料的污染较小，通过利用不含血清的培养基避免了污染，使得提纯更为有效。Binn等人(1984.J.Clincal.Microbiol.2028-33)测试了一些用于复制HAV的灵长类动物细胞和用于分离和生产大量病毒的最佳条件。通过在BSC-1细胞，一种迄今尚没有被用于人疫苗制备的异双倍体细胞系上，在摇瓶中进行无血清HAV生产显示出，在培养21天后可在上清液和细胞组分中发现病毒抗原。维持在支持病毒生长的无血清培养基中的细胞等同于维持在血清中的细胞。通过低速离心维持在无血清培养基中的冻融细胞的上清液和受感染的BSC-1细胞的上清液获得的候选HAV疫苗，由Binn等在1986年描述于J.Infect.Diseases153749-756中。Flehmig等人(1987.J.Medical Virol.227-16)用分离自持续地受感染的正常人胚胎的成纤维细胞的细胞培养物的上清液的HAV来制备候选HAV疫苗，其中的胚胎成纤维细胞生长在含有血清的无细胞致病作用的培养基中。因此，从由NUNC细胞工厂生产的大量上清液通过连续步骤分离和纯化而得到的HAV抗原被用于疫苗接种试验。然而，所有生长在细胞培养物中的HAV菌株具有不能有效率地释放病毒到培养物的上清液中的特性。尽管有多达50％的传染性病毒可被释放，然而典型地少于30％的传染性病毒是胞外的(Nasser等，1987.Appl.Environmental Microbiol.532967-2971)。因此，通常在未浓缩的培养物上清液中是不可检测抗原的且大容量的浓缩增加了此方法中HAV提纯的难度。因为HAV抗原不是被有效地释放到培养物的上清液中且大容量的浓缩是昂贵的(Bishop等，1994.J.Virol.Meth.47203-216)，因此所描述的大多数纯化方法利用来自胞内生产的病毒细胞溶解产物的HAV抗原作为生产HAV疫苗的来源(EP0339667；EP0583142，Andre等，1990，InMelnick(ed)Prog.Med.Virol.Basel，Karger 3772-95；Armstrong等，1993，J.Hepatology1820-26)；Hagen等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23209-215；Bader等，1996，Amer.J.Gastroenterol.91217-222，Hennessey等，1999，Vaccine 172830-2885，WO00/23574)。然而，这些方法是费时的，其使用细胞释放胞内生产的抗原所必需的去垢剂且需要强烈的和一系列纯化步骤来去除细胞中的去垢剂和污染物。为诱导保护性的免疫应答，有人提议，衣壳蛋白必须是折叠的且以正确的构象进行装配成而且前体蛋白不能引发保护性的免疫应答。成熟的HAV粒子由3个病毒衣壳蛋白(VP1，VP2，VP3)组成。通过几个连续的裂解可以以单一的前体分子(P1)获得这些蛋白。在病毒成熟和装配过程中形成了不同的中间体。裂解前的蛋白首先装配为五邻体结构，然后60个五邻体形成一个前病毒体。前病毒体由VP1，VP0和VP3组成。在最后对VP2和VP4中的VP0进行成熟切割后，由这些前病毒体获得了成熟的病毒体。VP4不存在于成熟的病毒体中。由细胞溶解产物和/或细胞培养物的上清液得到的HAV的大规模制剂含有成熟病毒体、前病毒体和前衣壳的混合群体(Bishop等，1997.Arch.Virol.1422147-2160；EP 339667，EP 339668)。成熟的病毒由多肽VP1、VP2和VP3组成，其中衣壳蛋白VP1和VP3包含主要的抗原位点且能够诱导中和抗体(Lemon等，1989，在Semler等编辑，微小RNA病毒的分子方面及检测。华盛顿特区ASM p 193-208)。人们已经进行了很多尝试来纯化HAV以及分离各种形式的HAV粒子。1997年Bishop等人(同上)利用线性梯度离心来分离不同的HAV粒子形式，并且发现密度为1.32-1.33g/cm3的HAV粒子是显示前病毒体和成熟病毒体不完全分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产完全的ＨＡＶ粒子的方法，包括下列步骤：用核酸降解试剂和蛋白酶处理来自ＨＡＶ感染的细胞培养物的细胞培养物上清液的ＨＡＶ制剂，以及分离所述的完全的ＨＡＶ粒子的纯化制剂。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：C陶尔，H迈尔，A米特雷尔，N巴雷特，
申请(专利权)人：巴克斯特健康护理股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]