新的VIP3毒素和应用的方法技术

本发明专利技术公开了具有高度抗广谱鳞翅目昆虫害虫活性的新的Ｖｉｐ３毒素。编码Ｖｉｐ３毒素的ＤＮＡ可以用于转化各种原核生物和真核生物的生物体以表达Ｖｉｐ３毒素。这些重组的生物体可以用于控制各种环境中的鳞翅目昆虫。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的新的Vip3毒素，其表达产生所述毒素的核酸序列，和制备该毒素的方法，及利用该毒素和相应的核酸序列控制昆虫的方法。
技术介绍
植物害虫是世界重要农作物损失的主要因素。在美国，每年单由非哺乳动物害虫包括昆虫的侵染就损失约80亿美元。除了农田作物损失外，昆虫害虫对于蔬菜和水果种植者，对于观赏花卉的生产者，和对于家宅园丁也是负担。主要通过化学杀虫剂的密集应用控制昆虫害虫，该化学杀虫剂可抑制昆虫生长，妨碍昆虫进食或繁殖，或引起死亡。因此可以达到良好的昆虫控制，但是这些化学药品有时也影响其它有益昆虫。化学杀虫剂广泛应用引起的另一问题是抗药性昆虫品种的出现。通过各种抗药性处理实践已经部分缓解了这种现象，但是对可替代害虫控制剂存在日益增加的需要。生物害虫控制剂，如表达杀虫毒素象δ-内毒素的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)株系也已经施用于农作物植物，并且具有满意的结果，提供了化学杀虫剂的可替代物或补充物。已经分离了一些编码这些δ-内毒素的基因，表明在异源宿主中它们的表达提供了用于经济重要昆虫害虫控制的另一种工具。特别地，转基因植物中杀虫毒素如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)δ-内毒素的表达提供了免受所针对的昆虫害虫侵害的有效保护，已经表达这种毒素的转基因植物已经商品化了，使得农民能够减少化学昆虫控制剂的施用。现在已经鉴定了其它非内毒素基因和它们编码的蛋白质。专利5,877,012，6,107,279，6,137,033和6,291,156，及Estruch等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.935389-5394)和Yu等(1997，Appl.Environ.Microbiol.63532-536)描述了称为Vip3的新一类杀虫蛋白质，这里并入所有这些文献为参考文献。Vip3基因编码序列编码芽孢杆菌(Bacillus)营养生长阶段期间产生和分泌的约88kDa蛋白质(营养杀虫蛋白质，VIP)。Vip3A蛋白质具有抗广谱鳞翅目害虫，包括但不限于小地老虎(BCW，Agrotis ipsilon)，草地粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)，烟芽夜蛾(TBW，Heliothis virescens)，和谷实夜蛾(CEW，Helicoverpa zea)的杀虫活性。最近，已经发现表达Vip3A蛋白质的植物抗半翅目昆虫害虫引起的进食损害。因此Vip3A蛋白质显示了独特的杀虫活性谱。其它的公开文献WO 98/18932，WO 98/33991，WO 98/00546，和WO 99/57282现在也已经鉴定了Vip3类蛋白质的同系物。控制昆虫害虫的化学和生物药剂的连续应用增加了昆虫发展对这种控制方法抗药性的机会。而且，每种控制剂仅仅可以控制几种特定的昆虫害虫。因此，需要开发出能为农民提供经济利益，并且是环境可接受的新的和有效的害虫控制剂。特别需要的是提供靶向广谱经济重要昆虫害虫的控制剂和有效控制昆虫株系的控制剂，所述昆虫株系对现存昆虫控制剂是抗药性的或能变得有抗药性，以及与目前控制剂比较具有增加的效力的控制剂。而且，期望药剂的施用最小化对环境的负担。
技术实现思路
本专利技术通过提供新的基因和毒素致力于满足对新的害虫控制剂的需要，所述新的基因和毒素不同于美国专利5,877,012，6,107,279，和6,137,033和Estruch等(1996)，和Yu等(1997)及WO 98/18932，WO98/33991，WO 99/57282，和WO 98/00546中所公开的基因和毒素。本专利技术提供了控制植物害虫的组合物和方法。特别地，提供了从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)分离的新vip3核酸序列，基本与其相同的序列，所述序列的表达产生了对经济上重要昆虫害虫，特别是侵染植物的昆虫害虫具有毒性的杀虫毒素。本专利技术进一步涉及由该核酸序列表达产生的新的杀虫毒素，含有该杀虫毒素的组合物和制剂，它们能抑制昆虫害虫存活，生长和繁殖的能力，或能限制与昆虫有关的作物植物损害或损失。本专利技术也涉及例如在制造具有增加杀虫活性的杂合毒素中或在重组基因方法如DNA改组中利用该核酸序列的方法。本专利技术进一步涉及制造毒素的方法和涉及例如在微生物中利用该核酸序列控制昆虫的方法或在转基因植物中利用该核酸序列提供免受昆虫损害保护的方法，并涉及利用杀虫毒素和包含该杀虫毒素的组合物和制剂的方法，例如向昆虫侵染的区域施用杀虫毒素或组合物或制剂或预防性处理昆虫易侵染的区域或植物以提供免受昆虫害虫侵害的保护。可以利用本领域通常公知的方法改造本专利技术的核苷酸序列以为了各种目的改变核苷酸序列，所述目的包括但不限于扩大杀虫活性谱或增加抗特异性害虫的特异性活性。通过随机片段化和基因片段和合成的寡核苷酸的PCR重装配的DNA改组可以用于基因工程改造核苷酸序列。这里所述新的杀虫毒素是高度抗昆虫活性的。例如，通过该杀虫毒素可以控制大量经济上重要昆虫害虫，如鳞翅目欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)，小菜蛾(Plutella xylostella)，草地粘虫(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，贪夜蛾(Spodoptera exigua)，西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)，小蔗杆草螟(Diatraea saccharalis)，细点突夜蛾(Helicoverpa punctigera)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)。可以单独使用或与其它昆虫控制策略联合使用杀虫毒素以提供具有最小环境影响的最大害虫控制效力。根据一个方面，本专利技术提供了包含编码毒素的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述毒素具有抗昆虫活性，其中所述核苷酸序列(a)具有与SEQ ID NO1核苷酸1981-2367杂交的互补序列，该杂交是在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中进行，同时在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；或者(b)与(a)的核苷酸序列同类编码；或(c)包含连续20个碱基对的核苷酸部分，其序列与(a)或(b)核苷酸序列的连续20个碱基对核苷酸部分相同；或(d)与SEQ ID NO1具有至少93％序列同一性；或(e)编码与SEQ ID NO2具有至少91％序列同一性的氨基酸序列。在这方面的一个实施方式中，分离的核酸分子包含具有互补序列的核苷酸序列，该互补序列与SEQ ID NO1核苷酸1981-2367杂交，该杂交是在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中进行，同时在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。在该方面的另一个实施方式中，分离的核酸分子包含与具有互补序列的核苷酸序列同类编码的核苷酸序列，该互补序列与SEQ ID NO1核苷酸1981-2367杂交，该杂交是在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包含编码具有抗昆虫活性的毒素的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：（ａ）具有与ＳＥＱＩＤＮＯ：１核苷酸１９８１－２３６７杂交的互补序列，该杂交是在５０℃，７％十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），０．５ＭＮａＰＯ↓ ［４］，１ｍＭＥＤＴＡ中进行的，并在６５℃，０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中漂洗；或者（ｂ）与（ａ）的核苷酸序列同类编码；或（ｃ）与ＳＥＱＩＤＮＯ：１具有至少９３％序列同一性；或（ｄ）编码与ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２具有至少９１％序列同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈志诚，GW瓦伦，F舒特科斯克，V卡拉米尔，
申请(专利权)人：辛根塔参与股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]