本发明专利技术公开了人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用。本发明专利技术所提供的人富含甘氨酸蛋白的活性片段是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：１）序列表中的ＳＥＱ ＩＤ №：１；２）将序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加和／或糖基化和／或羧基化和／或乙酰化和／或磷酸化修饰且具有抗菌作用的多肽。该人富含甘氨酸蛋白的活性片段可作为抗菌肽，用于制备具有抗菌作用的生物药物。还可将上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段编码基因插入质粒作为核酸疫苗用于抗菌。本发明专利技术的人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其编码基因可广泛用于需要抗菌治疗及处理的不同领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用。
技术介绍
抗菌素几乎与所有生物健康生存密切相关。抗菌素的发现，医治了大量致病菌感染个体，挽救了不计其数的生命，是人类生存第一需要的药物，发挥了巨大的社会经济效益。然而，近二十多年来，由于罕有新抗菌素家族的发现和由于抗菌素本身的特点及应用不当，抗药、耐药菌株快速产生，严重威胁生物体的健康，人类感染具有抗药性的金黄色葡萄菌而死亡的病例已有报道。抗菌肽的应运而生将带来生物医药领域的一场革命。大量研究结果表明，抗菌肽是生物体天然免疫系统的重要组成成分之一，它们保证了生物体在充满感染源的环境中健康生存。至今，已在大量昆虫、两栖类动物、高等植物、高等动物乃至人类鉴定出700余种抗菌肽。研究发现，这些抗菌肽通常分子量较小，具有良好的热稳定性质，抗菌谱广，抗菌作用较强，对耐药菌有效且靶菌不易或不产生耐药性。抗菌肽作用机理的研究表明，它通过与细胞膜的相互作用，直接影响细胞膜的稳定性，进而使细胞膜形成裂孔，导致细胞内容物外泄而杀死细菌。这种杀菌机理赋予了其具有广谱抗菌作用的基础。抗菌肽的上述优点奠定了其在未来生物学界广泛应用的美好前景。部分抗菌肽还兼具抗病毒、抗原虫及抗肿瘤的作用，进一步扩展了抗菌肽的应用前景。因此，近十多年来，关于抗菌肽研究的学术论文数呈直线上升，多种抗菌肽已进入临床前研究，抗菌肽药物的面市已为期不远。抗菌肽的研究尚不尽如人意，已发现的抗菌肽中，大多为非人源性，影响其发展成为生物药物的进程。部分抗菌肽具有较强的溶血作用，阻断了其成为生物药物的可能。寻找发现具有发展成为生物药物良好前景的抗菌肽已成为本研究领域的关键。
技术实现思路
人富含甘氨酸蛋白hL52的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰且具有抗菌作用的多肽。序列表中的SEQ ID №1是由19个氨基酸残基组成的多肽，名称为pCM-19，是人富含甘氨酸蛋白(序列3)的自氨基端的第42-60位氨基酸残基。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰。所述富含甘氨酸蛋白的活性片段优选为具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的多肽。所述富含甘氨酸蛋白的活性片段可通过多肽合成仪合成，也可以通过生物工程技术如利用微生物表达获得，其中以酵母表达系统为优选。上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因，以及含有上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因的表达载体、细胞系和宿主菌也属于本专利技术的保护范围。实验证明上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段可抑制革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阴性细菌鼠疫杆菌的生长，其抗菌作用机理为破坏细胞膜的完整性，并且无溶血作用，可作为抗菌肽，用于制备具有抗菌作用的生物药物。还可将上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段编码基因插入质粒作为核酸疫苗用于抗菌。本专利技术的人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其编码基因可广泛用于需要抗菌治疗及处理的不同领域。附图说明图1A为转化了pET-22b(+)空载体的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线图1B为转化了pET-22b(+)-UBF和pET-22b(+)-PTH的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线图1C为转化了pET-22b-hL52的阳性克隆1和8的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线图2A为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌BL-21生长的影响图2B为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌HB101生长的影响图2C为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌DH5α生长的影响图3为pCM-19局部直接点样对大肠杆菌BL21菌生长的影响图4为pCM-19多肽对大肠杆菌BL21生长的影响图5为不同剂量pCM-19多肽与BL-21细菌菌落生成数之间的量效关系图6为pCM-19多肽对减毒型鼠疫杆菌生长的影响图7A为加盐水对照组30分钟的流式细胞仪分析测试结果图7B为pCM-19与靶菌作用5分钟的流式细胞仪分析测试结果图7C为pCM-19与靶菌作用10分钟的流式细胞仪分析测试结果图7D为pCM-19与靶菌作用20分钟的流式细胞仪分析测试结果图7E为pCM-19与靶菌作用30分钟的流式细胞仪分析测试结果图8A-图8D为氨苄青霉素与pET22b(+)转化后获得氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BL21分别作用5、10、20和30分钟后PI着染细胞比例的变化图8E-图8H为pCM-19多肽与pET22b(+)转化后获得氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BL21分别作用5、10、20和30分钟后PI着染细胞比例的变化图9为不同剂量pCM-19对人外周血红细胞的溶血作用具体实施方式专利技术人利用抑制性差减杂交的方法，对LTC(long term culture)培养前后的小鼠骨髓基质细胞差异表达基因进行了大量筛选，获得了131个差异表达的EST克隆。生物信息学分析证实，这些克隆代表了26种已知或部分已知功能的基因和7条全新的基因，其中5条具有完整的开放阅读框架，3条已在GenBank注册，鼠源的mL52基因就是其中之一，该基因的全长cDNA序列521bp，其GenBankTM注册号为AY028425。相关内容参见《实验血液学杂志》2002第10期第177-182页。在得到鼠源mL52后，专利技术人根据鼠源基因设计一对引物(5’引物Pa5-CGATGCCGGTGGCCGTGGGTCCCT-3；3’引物Pb5-TTAGCATCGTATGCCCATTCCA-3)，通过PCR扩增人胎肝cDNA文库，获得了人富含甘氨酸蛋白(hL52)同源基因序列，完整的ORF序列共240bp(序列2)，以及根据ORF序列推测的氨基酸序列(序列3)。专利技术人利用生物信息学手段对序列进行了详细分析核酸序列比较结果显示hL52基因定位于人染色体20q11.21区域，由三个外显子组成，编码79个氨基酸的小分子蛋白；氨基酸序列分析结果表明，它具有明显的疏水区，提示该蛋白可能是一种分泌型蛋白或胞膜蛋白。在获得具有编码完整ORF的hL52基因后，专利技术人将该基因(序列2)构建到原核表达载体pET-22b(+)中，得到含有序列2的人源基因的重组表达载体pET-22b(+)-hL52。再将pET-22b(+)-hL52转化到大肠杆菌BL2 1中，比较IPTG存在和不存在两种情况下细菌生长状态的变化。hL52基因在不加IPTG诱导剂时不表达，而只在培养液中加入IPTG诱导后才大量表达；进一步地，在诱导条件下，如果hL52不具有抗菌活性，则同样不会影响细菌生长；但是如果hL52具有抗菌作用，则会明显影响细菌生长；在诱导条件下，随着培养时间延长，IPTG不断消耗，hL52的表达逐渐停止，理论上此时细菌的生长应逐渐恢复。每隔45分本文档来自技高网...
【技术保护点】
人富含甘氨酸蛋白的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：１）序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１；２）将序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加和／或糖基化和／ 或羧基化和／或乙酰化和／或磷酸化修饰且具有抗菌作用的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵士富，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。