一种羊奶及其制品中检测药物的方法技术

本发明专利技术提供一种羊奶及其制品中8大类74种禁限用药物检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)样品前处理：将待测样品使用酸性有机溶剂提取；并经过SPE柱净化，净化液经初始流动相溶解，待UPLC‑MS/MS检测(2)74种待测禁限用药物测定，在方法规定的仪器条件下，将经过前处理样品使用超高效液相色谱‑液质联用测定。本发明专利技术具有检测药物数量多，种类丰富，检测时间短，灵敏度高、结果准确稳定的优点，同时也弥补了羊奶及奶制品中无多种类、多数量药物同时检测空白，对保证消费者身体健康，提高羊奶及奶制品出口贸易竞争力具有重要意义。

A method for detecting drugs in sheep's milk and its products

The invention provides a goats'milk and its products in 8 categories of 74 kinds of restriction of drug detection method, the method comprises the following steps: (1) sample pretreatment: sample extraction using acidic organic solvent; and after SPE column purification, purification liquid after the initial mobile phase to be dissolved, UPLC detection MS/MS (2) 74 to measure the restriction of drug determination method in the provisions of the conditions of instrument, after the pretreatment of samples using ultra performance liquid chromatography LC-MS determination. The invention has the detection of drug quantity, variety, short detection time, high sensitivity, accurate and stable advantages, but also to make up for the simultaneous detection of multi species, multi drug and blank goats'milk in dairy products, to ensure the health of consumers, it is of great significance to improve the competitiveness of goats' milk and milk products export trade.

【技术实现步骤摘要】
一种羊奶及其制品中检测药物的方法
本专利技术涉及以一种禁限用药物的检测方法，特别是涉及羊奶及其制品中8大类74种禁限用药物检测方法。
技术介绍
奶及奶制品作为消费者膳食组成中不可或缺的部分，其营养组成和质量安全受到越来越多的关注，其中奶源从牛奶也逐步扩展到羊奶及制品，羊奶相比于牛奶，具有脂肪粒和蛋白微粒小、矿物质和维生素丰富，更容易被人体吸收的特点；且羊奶从基础结构到营养配比更接近于人奶，尤其适合婴幼儿食用，同时羊奶中аS-酪蛋白等异体蛋白含量较少，能大大降低过敏反应的发生。随着物质水平的提高，营养价值更高的羊奶及奶制品受到越来越多的追捧。随着养殖行业规模化发展，为治疗预防动物疾病、缩短生产周期，促进动物生长，兽药的使用极为普遍，目前畜禽养殖行业常用兽药主要有磺胺类、喹喏酮类、大环内酯类、苯并咪唑类、镇静剂类、抗病毒和截短侧耳素类等药物，但由于科学养殖知识的缺乏和经济利益的趋势，超剂量使用现象尤为突出，其次不法兽药生产企业为追求疗效，多种类兽药复方使用，加之不合理的休药期限，导致动物体内同时残留多种兽药；同时为促进动物生长和增重，铤而走险添加违禁药物以谋取私利的现象也时有发生，最终导致动物源性产品中禁限用药物残留超标问题频繁发生，近年来奶及奶制品食品安全事件也接连不断，对消费者身体健康造成潜在威胁，尤其对婴幼儿及体弱人群影响更为严重。动物源性食品中违禁药物残留的对人体健康危害主要包含以下方面：(1)急慢性毒性反应，当人体长期摄入残留药物超标的动物源性食品，因药物蓄积达到一定量时就会产生急慢性毒性反应，如磺胺类药物能够破坏人体造血机能；大环内酯类可致急性肝毒性；“瘦肉精”类药物可引起血管扩张、血压下降、心跳加快、呼吸加剧从而诱发或加重心脏病人的病情。(2)致畸、致癌、致突变作用，研究表明如果长期食用残留“三致”作用药物食品，最终可能导致人体产生致畸、致癌和致突变作用，如苯丙咪唑类药物具有致畸作用；磺胺二甲嘧啶等磺胺类药物能够诱发啮齿动物甲状腺增生，并具有致肿瘤倾向；喹诺酮类药物的个别品种被发现有致突变作用。(3)耐药性细菌产生，长期的禁限用药物残留暴露条件下，人体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌株大量繁殖，此外，抗药性R质粒在菌株间横向转移使很多细菌由单重耐药发展到多重耐药，耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，从而使人体疾病治疗过程中出现效果不佳或无药可用的危险。此外动物源性食品中禁限用药物残留还会导致过敏反应，如青霉素、四环素类、磺胺类等能使部分人群发生过敏反应甚至休克。为此，许多国家和组织通过对禁限用药物残留进行监测来评估动物源性食品安全风险和制定应对措施，常用的监测方法主要为筛查方法和确证分析方法，筛选方法主要以ELISA快速检测为主，确证方法主要有液相色谱、液质联用、气相色谱、气质联用为主，但随着食品质量安全风险形势的发展，现有的检测方法难以满足同一样品多种禁限用药物同时检测要求，主要存在问题有：(1)大多检测方法和标准以检测单一种类药物为主，多种类药物检测时，需分别多次处理样品，极大的浪费了人力、物力及财力(2)检测方法及标准检测基质覆盖不全面，如动物产品检测基质一般为肉和肝脏样品，少有肾脏样品；而奶及奶制品基质大多以牛奶为主，未见羊奶及奶制品样品(3)仪器和方法存在灵敏度低，重现性差、前处理繁琐、溶剂耗费量大等问题。因此为满足对样奶及奶制品质量安全监管，建立更多种类、更多数量兽药同时检测的确证方法尤为迫切。目前，用于动物源性产品中禁限用药物残留检测的方法主要有ELISA法，液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS/MS),气相色谱法(GC)、气质联用法(GC-MS/MS)，生物传感器和芯片技术。ELISA法以抗原-抗体间特异性结合反应为基础建立的快速筛选和分析方法，具有灵敏度高、特异性强、分析通量大、快速安全可靠等优点，此外因其操作简单，分析时间短是目前应用于现场检测的主要手段。但同时ELISA法因其特异性强决定其无法同时检测多种类药物；且因为其原理为抗原抗体特异性反应，导致其对溶剂的适用性要求就高，极易因为基质原因造成一定的假阳性和假阴性问题，此外ELISA方法还存在灵敏度不高，稳定性差等缺点，仅能对分析物做半定量分析。生物传感器和芯片技术将生物活性物质集成于换能器表面，并将分析物与活性物质之间的某种特异性反应所产生的信号转化成可识别信号，进而实现对分析物含量或浓度的测定。此类技术具有操作简单、特异性强、灵敏度高的优势，极大提升了检测通量，此外传感器体积小，便于携带，方便现场实时检测。因此近年来，传感器技术应用于禁限用药物残留分析检测是食品安全的重要研究领域；但生物传感器和芯片技术作为新兴的检测技术，因其保持生物活性物质和集成化的特点，对检测基质的处理要求和现有集成技术较高，因此极易造成结果的不稳定性，且存在造价和使用寿命等问题。液相色谱(HPLC)、液质联用(LC-MS/MS),气相色谱(GC)和气质联用(GC-MS/MS)等仪器分析方法，将色谱技术良好的稳定性和质谱技术较高的灵敏度相结合，充分发挥了仪器分析法准确度高，稳定性好，灵敏度高，选择性好的特点，在动物源性产品中禁限用药物定性定量分析方面优势明显，即使在基质干扰物质复杂情况下也依然能获得准确的测试结果，是目前主要的确证分析手段；但目前现有方法存在检测药物种类单一，药物数量少等缺点，极易造成风险药物的漏检；此外检测基质不够丰富，比如少有方法和标准研究日益受重视的羊奶及奶制品中禁限用药物残留状况，造成食品安全监管环节的盲区和死角，不利于我国食品安全整体水平的提升和出口贸易竞争力的提高。现有技术CN103760269公开了一种兽药残留的检测方法，其中公开了46种药物的检测方法，在该方法的检测中检测药物的种类十分有限，仅包括四环素类药物、β受体激动剂类药物、喹诺酮类药物和磺胺类药物，而对于其他类药物的没有能检测到。而实际生产中，需要测定更多种，特别是更多的类别的残留药物，因此，开发一种同时检测更多类别更多种的药物的方法，成为本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术检测禁限用药物数量少，种类少的问题，建立了涵盖β-受体激动剂(27种)、磺胺(15种)、喹喏酮(20种)、大环内酯(3种)、苯并咪唑(3种)、镇静剂(2种)、抗病毒(2种)和截短侧耳素类(2种)等8类74种兽药的超高效液相色谱质谱联用法；此外所建立方法针对羊奶及其制品等样品弥补了现有检测方法和标准不够全面的问题。具体来说，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种检测羊奶及其制品中禁用或/和限用药物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)样品的处理：将待测样品加入酸性有机溶剂提取后进行涡旋震荡提取，离心取上清液，离心得到的沉淀重复涡旋震荡提取一次，合并上清液，经SPE柱净化，净化液氮气吹干，使用初始流动相溶解后用于UPLC-MS/MS测定；(2)禁用或/和限用药物的测定：将步骤(1)得到的样品进行UPLC-MS/MS测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为WatersAcquityUPLCBEHC18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.0-3.5kV；源温为145℃-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测羊奶及其制品中禁用或/和限用药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)样品的处理：将待测样品加入酸性有机溶剂提取后进行涡旋震荡提取，离心取上清液，离心得到的沉淀重复涡旋震荡提取，合并上清液，经SPE柱净化，净化液氮气吹干，使用初始流动相溶解后用于UPLC‑MS/MS测定；(2)禁用或/和限用药物的测定：将步骤(1)得到的样品进行UPLC‑MS/MS测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；样品采集方式：采用多通道分时段采集模式。

【技术特征摘要】
1.一种检测羊奶及其制品中禁用或/和限用药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)样品的处理：将待测样品加入酸性有机溶剂提取后进行涡旋震荡提取，离心取上清液，离心得到的沉淀重复涡旋震荡提取，合并上清液，经SPE柱净化，净化液氮气吹干，使用初始流动相溶解后用于UPLC-MS/MS测定；(2)禁用或/和限用药物的测定：将步骤(1)得到的样品进行UPLC-MS/MS测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为WatersAcquityUPLCBEHC18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；样品采集方式：采用多通道分时段采集模式。2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述禁限用药物包括β-受体激动剂、磺胺、喹喏酮、大环内酯、苯并咪唑、镇静剂、抗病毒和截短侧耳素8类药物。3.如权利要求1或2所述的检测方法，其中所述禁限用药物为奥西那林、西马特罗、特布他林、沙丁胺醇、齐帕特罗、西布特罗、吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、非诺特罗、羟苄羟麻黄碱、羟甲基克伦特罗、克伦普罗、克仑塞罗、氯丙那林、克仑特罗、妥布特罗、莱克多巴胺、马布特罗、美托洛尔、马喷特罗、溴布特罗、福莫特罗、班布特罗、奥达特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、磺胺醋酰、磺胺二甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺塞唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛、磺胺苯酰、磺胺甲恶唑、磺胺地索辛、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹喔啉、吡哌酸、氧氟沙星、加替沙星、沙拉沙星、奥比沙星、曲伐沙星、加雷沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、吉米沙星、莫西沙星、司帕沙星、二氟沙星、那氟沙星、萘啶酸、氟甲喹、金刚烷胺、金刚乙胺、噻苯咪唑、阿苯达唑砜、奥芬达唑、克林霉素、罗红霉素、替米考星、沃尼妙林、泰妙菌素、氯丙嗪、氮哌酮中的一种、几种或全部。4.如权利要求1-3任一项所述的检测方法，步骤(2)所述梯度洗脱程序为：0-0.5min：甲醇的体积比为3.0％保持不变；0.5-2.0min：甲醇的体积比为3.0％-25.0％；2.0-3.5min：甲醇的体积比为25.0％保持不变；3.5-3.6min：甲醇的体积比为25.0％-40.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪斌，蔡英华，李颖，田亚平，姜艳彬，于雷，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京,11