本发明专利技术克隆了一种分离的２５ＫＤ突触相关蛋白（ＳＮＡＰ－２５）基因。该２５ＫＤ突触相关蛋白来源于硬骨鱼鲈鱼（Ｌａｔｅｏｌａｂｒａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ），该２５ＫＤ突触相关蛋白（ＳＮＡＰ－２５）的基因，它具有ＳＥＱ ＮＯ．１所示核苷酸序列，该基因含６１５个碱基对的ＤＮＡ。该２５ＫＤ突触相关蛋白的氨基酸序列与ＳＥＱ ＮＯ．２所示氨基酸序列具有至少８０－９０％的同源性。所述的该２５ＫＤ突触相关蛋白的编码是一个由２０４个氨基酸组成的活性蛋白质；其具有抑制ＨＩＴ细胞延迟反应器型钾离子通道（ｄｅｌａｙｅｄ ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ Ｋ↑［＋］ｃｈａｎｎｅｌ，Ｋ↓［ＤＲ］）生物学活性的功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域。具体地说，其是分离的25KD突触相关蛋白及其应用，其涉及一个硬骨鱼鲈鱼(Lateolabrax japonicus)的位于细胞膜的受体25kD突触相关蛋白(简称SNAP-25)的DNA序列，还涉及含有该蛋白基因的重组质粒以及表达该蛋白的重组菌株和细胞系。
技术介绍
在现有技术中，细胞胞吐及分泌作用是生物体最基本的生命现象之一。它维系着个体正常的新陈代谢和生命活动，涉及到生物体从细胞到个体的不同层次，涵盖生长、发育、生殖及防御等各个方面。在生命活动中，分泌蛋白首先是在细胞内质网合成，然后运输到高尔基体进行修饰与包装，最后转运到细胞膜分泌；分泌物质在各个亚细胞结构之间的运输，以及从亚细胞结构到细胞膜的运输都是由分泌运输囊泡完成的。在神经科学领域的研究发现，分泌作用中运输囊泡的组装、填充、贴附以及融合的整个过程，都在分子水平上受到精确的控制。一些与分泌有关的蛋白相继被发现，它们的功能逐渐被确认。其中之一就是首先在神经系统的突触发现的SNAP-25。此蛋白为调控分泌作用的一类膜受体蛋白质家族-SNARE蛋白家族的核心成员之一。该蛋白通过与其它SNARE蛋白的相互协调，共同作用，在分子水平，从空间上和时序上对细胞内运输和细胞外分泌——这一基本生命现象进行严格精密的调控。SNAP-25是1990年由Clary于牛脑膜中首先发现的一种膜蛋白。它主要在神经组织表达，在神经以外组织通常采用SNAP-23(Syndet)作为替代形式。SNAP-25的蛋白结构较为简单，一般由基因组中8个外显子共同表达，含202到206个氨基酸。在低等生物(如拟南芥、线虫)要更长一些(可达260个氨基酸)。目前对其序列已经有了清楚的认识。有关海洋动物SNAP-25的研究进行不多。对SNARE蛋白的研究相对集中在精卵融合这一生理现象。Schulz等人(1998)在研究棘皮动物海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)精子顶体反应等受精过程中发现了SNAP-25的同工型，其基因序列与哺乳动物SNAP-25有71％的碱基相同，它们参与了精子与卵子的识别与融合过程。对水生生物鱼类的研究方面，Rinsinger等人(1993)从电鳐神经末梢发现SNAP-25的同工型基因的表达。在1994年，Risinger，C.等人还从另一种水生生物-金鱼(Carassiusauratus)的cDNA文库中筛选出SANP-25a，SANP-25c和SNAP-25d三种基因，并对其基因型进行了比较分析。他还于1998年从斑马鱼cDNA文库中成功筛选出SNAP-25基因，对其基因组结构方面进行了分析，并与哺乳动物加以比较。同年，Sutton R.B.等研究了SNAP-25与其它SNARE蛋白之间的相互作用，极大地深化了对SNAP-25结构的认识。在我国，迄今为止尚没有有关SNAP-25研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个分离的25KD突触相关蛋白及其应用，该25KD突触相关蛋白具有调控细胞离子通道作用的受体蛋白——SNAP-25，及其基因结构和相应的氨基酸序列。该基因表达产物，在HIT细胞中，可以抑制延迟反应器型钾离子通道的活性。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的，克隆了一种分离的25KD突触相关蛋白(SNAP-25)基因。该25KD突触相关蛋白基因来源于硬骨鱼鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)，该25KD突触相关蛋白(SNAP-25)的基因，它具有SEQ NO.1所示核苷酸序列，该基因含615个碱基对的DNA。该25KD突触相关蛋白的氨基酸序列与SEQ NO.2所示氨基酸序列具有至少80——90％的同源性。所述的该25KD突触相关蛋白的编码是一个由204个氨基酸组成的活性蛋白质；其具有抑制HIT细胞延迟反应器型钾离子通道(delayed rectifier K+channel，KDR)生物学活性的功能。所述的该25KD突触相关蛋白的氨基酸序列的肽链分为四部分在靠氨基有两个螺旋卷曲A和B，均含约40个氨基酸；羧基末端也有一相似螺旋卷曲C，该螺旋卷曲B和C之间是一段具疏水性无规则卷曲结构；其间第85-92个氨基酸序列之间为一段特殊的序列是4个半胱氨酸富集区，该4个半胱氨酸通过十六烷酰化锚定在细胞膜内侧一面；在羧基端的末尾肽段上有细菌性神经毒素-肉毒杆菌毒素(BoNT/A和BoNT/E)的酶切降解位点。在所述的该25KD突触相关蛋白，其在SNARE循环中以两个螺旋臂结构与另外两个SNARE蛋白VAMP2和Syntaxin1形成稳定的三聚体——7S复合体，该7S复合体是促进运输泡膜和靶膜靠拢的主要推动力。本专利技术的SNAP-25的应用效果在于该SNAP-25能抑制胰脏β细胞延迟反应器型钾离子通道的活性。SNAP-25被神经毒素A特异性地降解，可以解除细胞自身或是外源表达的SNAP-25对钾离子通道的抑制作用。延迟反应器型钾离子通道是神经和神经内分泌细胞膜表面电流重要的调节蛋白。该离子通道的调节直接影响钙离子通道开启的时间和强度。在胰脏β细胞，SNAP-25通过抑制延迟反应器型钾离子通道，从而开启钙离子通道，导致β细胞分泌胰岛素。由于对血糖敏感的胰岛素分泌在β细胞是由延迟反应器型钾离子通道调控的，因而SNAP-25这一抑制钾通道，开启钙通道，从而促进胰岛素分泌的作用，具有将SNAP-25开发成为新的促进胰岛素分泌的治疗糖尿病药物的前景。附图及其实施例附图说明图1为鲈鱼SNAP-25蛋白基因结构示意图。图2为25KD突触相关蛋白的基因序列图(SEQ NO.1所示核苷酸序列图)。图3为25KD突触相关蛋白的氨基酸序列图(SEQ NO.2所示氨基酸序列图)。图4为HIT细胞的全细胞钾离子通道电流图。图5为HIT细胞电压电流曲线图。本专利技术的保护范围不仅局限于以下实施例中。参见图1——5，本专利技术的具体技术步骤如下本专利技术是从鲈鱼脑组织得到总RNA，通过RT-PCR得到cDNA链。设计引物得到部分序列。重新设计引物进行RACE，克隆得到25kD突触相关蛋白基因。它是615bp的DNA，编码一个由204个氨基酸组成的蛋白质。通过分子生物学方法可以获得含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌或者真核细胞系，表达具有生物学活性的该基因。(一)鲈鱼总RNA的提取取鲈鱼脑组织100mg，加入液氮研磨成细粉状，再加入1ml TRIZOL试剂，置室温下匀化5分钟后，加入200μl氯仿剧烈振荡15秒，室温下温育3分钟。4℃下以12,600rpm转速离心15分钟。获取界面上层液体加入250μl高浓度盐溶液(0.8M乙酸钠和1.2M氯化钠)和250μl异丙醇，混匀后于室温下沉淀10分钟，再在4℃以12,600rpm转速离心10分钟。移去上清后用1ml 70％乙醇漂洗沉淀和离心。以20μlDEPC处理过的双蒸水(无RNase)55℃溶解RNA沉淀10分钟。总RNA溶液于紫外分光光度计测定A260nm/280nm波长的紫外吸收值，确定提取RNA的浓度及纯度。(二)逆转录合成第一条cDNA链取2.0ug总RNA，加入1μl 50pM的随机引物，以双蒸水(无RNase)稀释，70℃ 5分钟破坏RNA二级结构后置冰上骤冷。依次加入5μlM-M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的２５ＫＤ突触相关蛋白（ＳＮＡＰ－２５）的基因，其特征在于：该基因来源于硬骨鱼鲈鱼（Ｌａｔｅｏｌａｂｒａｘｊａｐｏｎｉｃｕｓ），该２５ＫＤ突触相关蛋白的基因序列与ＳＥＱＮＯ．１所示核苷酸序列具有至少８０－－９０％的同源性，该基因含６１５个碱基对的ＤＮＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓航，陈魁，纪俊之，海勃特杰萨诺，
申请(专利权)人：国家海洋局第一海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[]
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