本发明专利技术涉及一种趋化小肽与抗肿瘤×抗ＣＤ３双特异抗体的融合蛋白，其特征在于由ＣＣ家族趋化因子ＳＬＣ（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，次级淋巴组织趋化因子）的Ｎ末端十八肽、（ＧＧＧＧＳ）↓［２］连接肽、抗卵巢癌×抗ＣＤ３双特异抗体依次连接而成。其Ｃ末端可以带有ｃ－ｍｙｃ标签和Ｈｉｓ↓［６］标签。本发明专利技术还涉及一种构建、表达和纯化该融合蛋白的方法；该融合蛋白的编码序列、表达载体和含有该载体的宿主细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程抗体领域，更具体地，涉及一种趋化因子SLC(Secondary lymphoid tissue chemokine，次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白；这种融合蛋白的构建、表达和纯化方法；含有该融合蛋白的载体和大肠杆菌宿主菌。
技术介绍
随着抗体工程的发展，免疫治疗是继手术、放疗、化疗后，又一治疗肿瘤的重要方法。理想的治疗方案应是针对肿瘤细胞的特异性高效杀伤的，即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞的双特异抗体，是这个方案的较理想的候选。它一方面针对肿瘤，实现与靶肿瘤细胞的特异性结合，另一方面将效应细胞富集在肿瘤细胞周围，模拟天然配体的作用，在肿瘤部位与效应细胞引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤的特异性杀伤和裂解(参考文献1-10)。但富集在肿瘤部位的效应细胞的数量毕竟有限，使这一作用难以得到最大的发挥。趋化因子的发现使这一问题的解决出现新的曙光。趋化因子(趋化性细胞因子的简称)是一由小分子(8-10KD)的碱性分泌蛋白组成的复杂超家族，对各种白细胞有趋化效应(参考文献11-15)。根据N末端半胱氨酸的数量和位置，趋化因子分为四个亚家族CC，CXC，CX3C和C。其中SLC是CC家族的成员(参考文献16)，主要在次级淋巴组织(如脾脏、淋巴结、派氏集结、淋巴内皮中)表达，对T淋巴细胞、B淋巴细胞、成熟的树突状细胞有趋化作用。最近，一些趋化因子的三维结构已经得到解析(参考文献17-22)，从已有的资料看趋化因子的三维结构是高度保守的，他们大都有一柔性无序的N末端，而后是呈螺旋转角的N末端环形区，接着是三个反平行的β折叠，最后是C末端α螺旋，N末端和N末端区通过两个二硫键连接到β折叠上。人们通过截短N末端区或对N末端区和N末端环形区进行丙氨酸扫描，证明了这两个区域在配体结合和激活受体是必须的(参考文献23-26)。Pius Loetscher等人证实SDF-1的N末端区和N末端环形区对其受体CXCR4有足够的结合活性，对表达该受体的淋巴细胞有一定的趋化活性(参考文献27)。本实验室也证实CCL21的N末端区和N末端环形区对受体CCR7的结合活性很高，对树突状细胞和T淋巴细胞有相当的趋化活性。结合双特异抗体与趋化因子的特点，本专利技术人已成功构建了趋化因子SLC的N末端十八肽和抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白，并已证明该融合蛋白即有对表达CCR7受体的细胞结合和趋化活性，又具有双特异抗体对相应的肿瘤细胞的结合和杀伤活性。这样该融合蛋白在双特异抗体的导向作用下到达肿瘤部位，而后发挥趋化作用将足够量的树突状细胞和T淋巴细胞吸引到肿瘤部位，杀伤肿瘤，这样可以高效地治疗肿瘤。
技术实现思路
本专利技术将趋化因子CC家族SLC的N末端十八肽，抗卵巢癌单链抗体×抗CD3单链抗体依次相连构建趋化因子SLC(Secondary lymphoid tissuechemokine，次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白；这一构建物能将二者的优点充分发挥。一方面，利用SLC的N末端十八肽的趋化作用，吸引T淋巴细胞和树突状细胞到相应部位；另一方面，利用抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的桥连作用，特异性激活T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞。该融合蛋白在卵巢癌的免疫治疗领域，具有较大的应用前景。因此，本专利技术的一个目的是提供一种趋化小肽与双特异抗体的融合蛋白。在本专利技术的一个实施方案中，所述趋化小肽是CC家族趋化因子SLC(次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽(SDGGAQDCCLKYSQRKIP)。在本专利技术的另一个实施方案中，所述双特异抗体是抗肿瘤×抗CD3双特异抗体。在本专利技术中优选所述抗肿瘤×抗CD3双特异抗体是抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述融合蛋白是由CC家族趋化因子SLC(次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)2连接肽、抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体依次连接而成。优选所述融合蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所编码，其C末端可以任选地带有C-myc(氨基酸序列为EQKLISEEDLN)和His6标签。本专利技术另外一个目的是提供一种表达载体，其特征在于包含权利要求1-6中任何一项所述融合蛋白的编码基因。优选所述载体是p18TBHL。本专利技术还提供含有上述载体的宿主细胞，优选大肠杆菌。本专利技术另一方面还提供一种纯化上述任一种融合蛋白的方法，其特征在于联合采用DEAE阴离子交换树脂和Ni亲和柱进行纯化。更具体地，按照本专利技术的一方面，提供了一种治疗卵巢癌的趋化因子SLC的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白。在本专利技术的另一方面，提供了一种构建趋化因子SLC的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白的方法。优选本专利技术所述的融合蛋白的氨基酸序列如以下SEQ ID NO2所示。SDGGAQDCCLKYSQRKIPGGGGSGGGGSLELEDVQLLESGPEAKKPGETVRISCKASGYTFTTAGMQWVQKMPGKGLKWLGWINTNSEVPKYAEDFRGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATFFCARSFTWGTMDYWGQGTPVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLELKEFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSELDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRATSGGGGSGGGGSGGGGSSREVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSS(粗体部分是趋化因子SLC的N末端十八肽，下划线部分是(GGGGS)2连接肽，以下部分是抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体) 更优选编码本专利技术所述融合蛋白的核苷酸序列如以下SEQ ID NO1所示。agcgatggtggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccgggtggtggtggttctggtggtggtggttctctcgagctcgaggatgtgcagctgctggagtctggacctgaggcgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaactgctggaatgcagtgggtgcaaaagatgccaggaaagggtttgaagtggcttggctggataaacaccaactctgaagttccaaaatatgca本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种趋化小肽与双特异抗体的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄华樑，宋景震，王祥斌，春雷，朴锦华，张众，林晴，
申请(专利权)人：北京安波特基因工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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