本发明专利技术涉及一种电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法。包括电脉冲渗透前细胞的处理，即将新鲜血液离心，弃去血浆及白膜，用ｐＨ＝７．４的等渗磷酸盐缓冲溶液在离心机中离心，洗涤，弃上清液，再与配置好的海藻糖以一定的体积比混合均匀，得到红细胞溶液，取一定量，放入电脉冲仪的电击杯中，进行电脉冲渗透，控制电压：３００ｖ、脉宽：１ｍｓ、频率：１次／１分钟，共四次，经过电脉冲渗透过的红细胞溶液，用ｐＨ＝７．４磷酸盐缓冲液洗涤三次得到电脉冲载糖溶液，并测得细胞内的海藻糖浓度达到６３．６８ｍＭ。与目前较好方法为高渗法（细胞外的海藻糖浓度为８００ｍＭ时，载入的效果为３４ｍＭ）相比，本发明专利技术方法的海藻糖载入浓度明显的提高了，从而有利于红细胞的冻干保存。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，特别是用电脉冲渗 透将海藻糖载入红细胞内的方法。
技术介绍
海藻糖是一种优良的冻干保护剂，当适当提高细胞内海藻糖浓度 时，可以提高细胞冻干后的存活率，因此人们希望提高细胞内海藻糖 的浓度。但由于细胞膜是一种非渗透性膜，对于海藻糖这种非渗透性 的物质很难进入细胞内部，即使能够用一般的方法载入，效果也不是 太理想。目前常用的方法主要有1 、利用内吞作用(endocytosis)分别将海藻糖弓I入人间叶干细胞 (MSCs， mesenchymal stem cells)禾口血小板中。此方法载入量较少。2、 利用转基因的葡萄状球菌a-溶血素，它是一种可打孔的蛋 白质，通过它产生横跨膜孔(transmembrane pores)来使细胞膜有可 逆的渗透性。此方法操作复杂且得到的样品量较少。3、 Gyana提出一种有效的、方便的将海藻糖引入红细胞的方法， 我们称此法为"Gyana孵育法"。该方法利用红细胞膜的热力学特性 (thermal properties),在37。C条件下孵育7h可以将足量的海藻糖 载入红细胞内。在胞外海藻糖浓度为800mM时，胞内海藻糖浓度可以 达到34mM，溶血率为15%。此方法的载入效果比以前的方法都好，但 是耗时长，溶血率较大，并且载入效果有待进一步提高。
技术实现思路
为了解决上述方法中存在的操作烦琐、耗时长、实验样品量少、载入效果不太明显等问题，本专利技术提出了一种通过电渗透的方法将海 藻糖载入红细胞内，通过选择合适的细胞外海藻糖浓度和控制电渗透 的参数，可以达到理想的载入效果。 本专利技术采用的技术方案电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法(1) 电渗透前细胞的处理先将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，将红 细胞用等渗pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min，反复 洗涤3次，弃去上清液，得洗涤红细胞。将得到的洗涤红细胞与800mM 的海藻糖溶液以1:1. 5的比例混合均匀，得到红细胞溶液。(2) 红细胞溶液的电脉冲渗透 将得到的加入了海藻糖的红细胞溶液取400微升放入间距为2mm的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并将电脉冲渗透的参数设置 如下电压300v、脉宽lms、频率为1次/分钟，共四次。在此参数 下进行红细胞的电脉冲实验。(3) 细胞内海藻糖浓度的提取 将经过电渗透的红细胞溶液用pH=7.4的等渗磷酸盐缓冲液以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得到电脉冲渗透 红细胞溶液。取电脉冲渗透过的红细胞溶液lml加入10%的三氯乙酸 3ml混合均匀，在8(TC恒温水浴箱中用生胶带密封加热lh后再以 3500r/min离心5min，收集上清液，如此提取3次，得到细胞内的海 藻糖的提取液。 本专利技术的技术效果本专利技术的一种电渗透的载糖方法在红细胞中的使用，通过三氯 乙酸提取后，经过硫酸蒽酮法测定，细胞内的海藻糖浓度最高可高达63. 68mM，与目前现有技术中报道的红细胞在细胞外海藻糖浓度为 800mM的"Gyana孵育法"的载糖浓度为34mM相比(测定方法同样是 硫酸蒽酮法)，得到了很大的提高，且此方法还具有操作方便，省时 省力的特点。 附图说明图1，海藻糖浓度与吸光度对应关系图； 具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术进一步详细描述，但不限制本专利技术。 实施例电脉冲仪美国BTX公司BCM-830脉冲仪(电穿孔仪) 胞内海藻糖浓度的计算(1) 海藻糖浓度与吸光度的关系图标准曲线的制作 取已知各浓度海藻糖的溶液lml加入2g/L硫酸蒽酮溶液4ml，在冰水浴中摇匀冷却，沸水精确煮沸10min，再用流水冷却10min。 在625nm处以空白管调零，用lcm光径的比色皿测定各管吸光度值， 绘制海藻糖浓度与吸光度的关系，见附图l。(2) 细胞内的海藻糖浓度计算 用标准曲线方法测定出提取液中的海藻糖浓度，按照如下公式计算出细胞内的海藻糖浓度其中 <formula>formula see original document page 5</formula>Ci——细胞内海藻糖浓度，mmol/L, C一萃取液中海藻糖的浓度，m——海藻糖的分子量，取378. 33g/mol， n——红细胞的计数，xl0(12)/L, V——红细胞的平均体积，fL，Vb——红细胞不可渗透体积，fL，根据文献报道取值为55. 21%V利用电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法(1) 电渗透前细胞的处理先将健康人新鲜血液以2500r/min离心5min,弃去血浆及白膜， 将红细胞用等渗pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min， 反复洗涤3次，弃去上清液，得洗涤红细胞。将得到的洗涤红细胞与 800mM的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均匀，得到红细胞溶液。(2) 红细胞溶液的电渗透 将得到的加入了海藻糖的红细胞溶液取400微升，放入间距为2mm的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并将电脉冲渗透的参数 设置如下电压300v、脉宽lms、频率为1次/1分钟，共4次。在 此参数下进行红细胞的电脉冲实验。(3) 细胞内海藻糖浓度的提取 将经过电渗透的红细胞溶液用PH=7. 4的等渗磷酸盐缓冲液溶液以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得到电渗透 红细胞溶液。取电渗透过的红细胞溶液lml加入10%的三氯乙酸3ml 混合均匀，在8(TC恒温水浴箱中用生胶带密封加热lh后再以 3500r/min离心5min，收集上清液，如此提取3次，得到细胞内的海 藻糖的提取液，细胞内海藻糖浓度的最大值为63. 68mM。本专利技术的电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法与目前现有 技术中报道的红细胞在细胞外海藻糖浓度为800mM的"Gyana孵育 法"的载糖浓度为34raM相比，载入效果得到了很大的提高，且此方 法还具有操作方便，省时省力的特点。权利要求1、一种利用电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法，其特征在于含有如下操作步骤(1)电脉冲渗透前细胞的处理将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，将红细胞用pH＝7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液在离心机中以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得红细胞，将此红细胞与配置好的海藻糖浓度为800mM、KCl为5mM的溶液以1:1.5的体积比混合均匀，得到红细胞溶液；(2)电脉冲渗透控制参数的选择取上述步骤(1)中所得的红细胞溶液400微升，放入间距为2mm的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并设定电脉冲渗透时的控制参数为电压300v、脉宽1ms、频率1次/1分钟，共四次；(3)电脉冲渗透后红细胞的处理将上述步骤(2)中经过电脉冲渗透过的红细胞溶液，用pH＝7.4的等渗磷酸盐缓冲液以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得到载入海藻糖的红细胞悬浊液。全文摘要本专利技术涉及一种电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法。包括电脉冲渗透前细胞的处理，即将新鲜血液离心，弃去血浆及白膜，用pH＝7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液在离心机中离心，洗涤，弃上清液，再与配置好的海藻糖以一定的体积比混合均匀，得到红细胞溶液，取一定量，放入电脉冲仪的电击杯中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法，其特征在于含有如下操作步骤： （１）电脉冲渗透前细胞的处理 将新鲜血液以２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去血浆及白膜，将红细胞用ｐＨ＝７．４的等渗磷酸盐缓冲溶液在离心机中以２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，反复洗涤３次，弃去上清液，得红细胞，将此红细胞与配置好的海藻糖浓度为８００ｍＭ、ＫＣｌ为５ｍＭ的溶液以１∶１．５的体积比混合均匀，得到红细胞溶液； （２）电脉冲渗透控制参数的选择 取上述步骤（１）中所得的红细胞溶液４００微升，放入间距为２ｍｍ的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并设定电脉冲渗透时的控制参数为电压：３００ｖ、脉宽：１ｍｓ、频率：１次／１分钟，共四次； （３）电脉冲渗透后红细胞的处理 将上述步骤（２）中经过电脉冲渗透过的红细胞溶液，用ｐＨ＝７．４的等渗磷酸盐缓冲液以２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，反复洗涤３次，弃去上清液，得到载入海藻糖的红细胞悬浊液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周新丽，刘建峰，刘宝林，周国燕，袁骥，宋晨，黄焕，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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