本发明专利技术公开了一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ＳｈＺＦＰ１基因序列，是以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因ＣＤＳ序列的保守区设计简并引物，从受干旱处理的甘蔗组织中提取总ＲＮＡ，用ＰＣＲ法扩增，结合ＲＡＣＥ技术克隆到甘蔗受水胁迫相关的锌指蛋白（ＳｈＺＦＰ１）基因的全长表达序列。本发明专利技术为研究甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因在抗旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于甘蔗水分胁迫 相关的锌指蛋白基因序列。
技术介绍
甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90% 以上，同时甘蔗也是一种重要的能源植物。但我国甘蔗生产的立地条 件差，旱地蔗面积占全国植蔗面积的85%以上，因此干旱是我国甘蔗 生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，并严重影响甘蔗的产量和 品质。克隆与表达甘蔗干旱胁迫相关的某些基因，已经成为当前研究 热点之一。干旱会导致植物失水而引发渗透势的变化，引起渗透胁迫。植物 感受干旱后，胁迫信号经历一系列传递过程，最后诱导特定功能基因 的表达，在生理生化上作出调节反应。研究表明，转录因子在抗旱基 因表达调控中起着重要的作用。其中锌指蛋白是一类在真核细胞中普 遍存在，作为基因转录因子参与细胞内基因表达调控的核酸结合蛋白 质，是真核细胞基因调控中起关键作用的一类调控因子。目前，人们 已经从拟南芥、矮牵牛、水稻、大豆、棉花等植物中克隆了许多编码锌指蛋白的基因，并对其结构及功能进行了研究；利用转基因技术， 也将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在目标植物中过量表达后，能对植物起到增强抗逆性的作用，说明锌指蛋白在增强植物逆境抗性 方面有着广阔的应用前景。因此，克隆甘蔗水分胁迫相关的锌指蛋白 基因将有利于研究甘蔗锌指蛋白基因在甘蔗抗旱反应中的作用，进而 为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFPl基 因序列，是通过以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因的CDS序列 保守区设计简并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘 蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因的全长表达序列。其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO.l所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2 所述。本专利技术的目的通过以下技术措施实现1、总RNA的提取甘庶茎节总RNA的提取采用Invitrogen公司的TRIzol试剂，试 验步骤参照TRIzol试剂说明书。2、 cDNA第一链的合成采用Invitrogen公司的Superscript TM III反转录试剂盒进行反 转录合成cDNA第一链(方法见说明书)。3、 引物设计与引物合成从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的水分胁迫相 关锌指蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对， 确定保守区，根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为256bp。引物设计后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 引物序列为ShZFP 1F: 5'-AGATGATAATGARGCAGGAGC國3' ShZFP 1 R: 5'-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC誦3'4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用简并引物进行PCR扩 增，所扩增的PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶 中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体 中，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。 经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA交由上海生工 生物工程技术服务有限公司进行双向测序。根据己得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末 端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的 基因的3'和5'末端进行PCR扩增。在此3，RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由 外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物作为模板，利用内侧 引物和接头引物再进行PCR扩增。 基因外侧引物5'-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3 ， 基因内侧引物5' -ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3 ， 接头引物5'-GGCCACGCGACTAGTAC-3，在5'RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C) 尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再用内侧引物和OligodG进行 第二次PCR扩增。基因外侧引物5，-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3 ，基因内侧引;，-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3'Oligo匿dG: 5，-GGGGGGGGGGGGGGGH隱3'所得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测 后，将PCR产物纯化并克隆到pMD-18T载体中转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆，交给上海生工生物工程技术服务有限 公司进行双向测序，测序所得序列再与简并引物扩增所得的序列利用 Clustal W软件进行拼接。5、对甘蔗锌指蛋白基因的测定将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为甘蔗锌指 蛋白基因序列。比对结果<formula>formula see original document page 6</formula>本专利技术的优点干旱是我国甘蔗生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，严重 影响甘蔗的产量和品质。培育丰产优质抗旱的甘蔗新品种、提高甘蔗的水分利用效率是提高我国甘蔗糖业国际竞争力的核心技术。因此， 本基因的获得，不仅为研究甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因在甘蔗抗 旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理奠定基础，而且还将 为甘蔗抗旱遗传改良提供参考。具体实施方式 下面用实施例对本专利技术作进一步说明。1、 总RNA的提取取甘蔗茎节约O.lg于液氮中研磨成粉,加入lml Trizol进行匀浆， 按照试剂盒使用说明提取总RNA。2、 cDNA第一链的合成取甘蔗总RNA约5ug与反转录引物(oligo-dT接头引物)lpL (10pmol/L)混合，7(TC加热5min后，立即放置冰上，然后加入 5xbuffer 5jiL， 10mmol/L dNTP混合液2.5pL， Ribonuclease inhibitor 0.5pL， M-MLV反转录酶0.5)iL，反应体系为25pL。反应过程为42°C 60min， 70°C 15min，最后放入-80。C保存备用。3、 引物设计与引物合成从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的锌指蛋白同 源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区， 根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为256bp。引物设计 后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为ShZFP 1F: 5'-AGATGATAATGARGCAGGAGC-3'ShZFPlR: 5'-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC-3'4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守引物进行PCR扩 增，反应体系为10xPCR反应缓冲液5|iL， 25mmol/L MgCl2 3(iL， 2.5mmol/L dNTP 2(iL， lOnmol/L引物ShZFPlF和ShZFPIR各2|iL， Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50pL。反应条件为l个 循环，94。C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ＳｈＺＦＰ１基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡文伟，陈萍，张树珍，杨本鹏，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]
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