本发明专利技术公开了猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法，属于生物疫苗制备技术领域。该疫苗可通过在ＰＲＲＳＶ ＧＰ５和Ｍ蛋白之间插入一具有自我裂解的ＦＭＤＶ ２Ａ基因相连接，构建成ＧＰ５－２Ａ－Ｍ融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体ｐＡｄＥａｓｙ－１同源重组，经酶切后，转染ＨＥＫ－２９３Ａ细胞，得重组腺病毒ｒＡｄ－ＧＰ５－２Ａ－Ｍ，经纯化、扩增等工艺、步骤制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。本发明专利技术构建的聚合蛋白ＧＰ５－２Ａ－Ｍ在表达后即自我裂解为ＧＰ５和Ｍ蛋白，发挥出ＧＰ５的病毒中和与Ｍ蛋白的免疫功能；其疫苗效价稳定，毒价在１０↑［１０．４３］ＴＣＩＤ↓［５０］／１．０ｍｌ，兼有常规弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性；可在猪繁殖与呼吸综合征的防治工作中推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物疫苗
，尤其属于对猪繁殖与呼吸综合征进行免疫保 护的二价重组腺病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，以妊娠母猪流产、死胎、 弱仔等繁殖障碍及仔猪的呼吸道征状和高死亡率为特征的传染病。自1987年在北美首次报道以来，至今几乎扩散到全球所有养猪业发达的国 家和地区，给养猪业及其产品贸易造成了巨大的经济损失，已成为养猪业的主 要病毒性疾病之一。我国于1995年底爆发该病，随后迅速蔓延到全国大部分省 份。近年来PRRS疫情又有加重趋势，且混合感染和持续性感染状况严重。目前 用于预防PRRS的疫苗主要是传统疫苗一弱毒苗和灭活疫苗。尽管弱毒苗能提供 较好的免疫保护，但存在毒力返强和散毒的危险；而灭活苗诱导产生的抗体水平 很低，且极不稳定。因此，研制更安全、更有效的疫苗来预防和控制该病的发 生与流行已迫在眉睫。PRRSV是一种单股正链的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉 炎病毒科(Arterividae)动脉炎病毒属(Artervirus),同属的还有马动脉炎 病毒(EAV)、小鼠乳酸脱氢酶增高征病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。其基因 组大小约15kb，具有9个开放阅读框架(ORFs)，且彼此相互嵌套。ORFl(包括 ORFla和ORFlb)编码病毒的复制酶，其大小约占全基因组的3/4; ORFs 2 4分 别编码病毒的GP2a、 GP2b、 GP3和GP4 4种次要结构蛋白，ORFs 5 7编码3种主要结构蛋白GP5、 M和N。 GP5为囊膜糖蛋白，是一种多功能蛋白，参与细胞 免疫与体液免疫，尤其是中和抗体的产生，是基因工程疫苗设计的主要靶抗原； M蛋白是非糖基化膜蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导产生一定的中和抗体和 特异性细胞免疫应答，在介导病毒的吸附和诱导细胞免疫中具有重要作用；而 GP5与M蛋白可通过二硫键形成GP5/M异源二聚体，对病毒装配起重要作用，并 介导病毒吸附宿主细胞过程。目前，大多数研究者为了发挥GP5的病毒中和优势作用和M蛋白的细胞免疫 作用及两者所形成的二聚体对病毒进入靶组织和细胞的作用，通过不同的表达 系统共表达和融合表达此二者，即在同一表达系统中使用双启动子(Yunbo Jiang et al. ， 2006， Vaccine, 24,2869-2879; Qisheng Zheng et al" 2007, Virus Genes, 35,585-595);或在GP5和M蛋白基因之间引入内部核糖体进入位点(IRES)(李 俊等，2006，动物医学进展，27(10) :78-81);或通过一柔性多肽Linker序列 (Wenming Jiang et al" 2006, Veterinary Immunology and Immunopathology ， 113,169-180)将GP5和M蛋白基因连接一起的表达策略。但这些策略存在一些 缺陷，比如被表达的基因起始效率低、上游基因与下游基因的表达严重不平衡、 启动子之间相互干扰、被表达蛋白性质与其天然蛋白的性质不尽相同等问题。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对以往为利用GP5和M蛋白基因功能，所采用的双启动子、 或引入内部核糖体、或通过一柔性多肽序列等将两者相连接表达策略所存在的 被表达基因起始效率低、上游基因与下游基因表达严重不平衡、启动子之间相 互干扰、或被表达蛋白性质与其天然蛋白性质不尽相同等缺陷，研制一种能克 服上述缺陷的，并使受体猪能产生针对PRRSV特异性的中和抗体和较强的细胞 免疫力，以达到有效控制、治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型二价重组腺病毒基因工程疫苗；本专利技术的另一目的是提出该疫苗的制备方法。 本专利技术目的通过以下技术方案得以实现猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，该疫苗可通过在PRRSV GP5和M 蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV 2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋 白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-l同源重组，将重组病毒DNA经酶切， 转染HEK-293A细胞后，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经腺病毒纯化、扩增等工 艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的制备方法，该方法按以下步骤进行(1) GP5-2A- M融合基因的构建根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332 和FMDV China/99 0型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04 毒株GP5、 M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下AdGP5: 5' -CGC f CT i CCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TG-3'AdGP5-2A: 5" -AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAG ACG ACC CCA-3'AdM-2A:5， -TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC MC CCC GGA CCC ATG GGG TCG TCT CTA-3'AdM: 5' -TAT (707 TAT TTG GCA TAT TTA AC-3'以Marc-145细胞增殖NB/04毒株，提取其RNA，以AdM引物作RT;然后以 cDNA产物为模板，应用PCR技术扩增出NB/04毒株含FMDV 2A基因的GP5和M 全基因，再通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、 2A和M蛋白基因 融合为GP5-2A- M融合基因；(2) 穿梭载体pShuttle-CMV- GP5-2A-M的构建在步骤(l)融合基因GP5-2A-M的GP5的上游和M的下游引物的5'端引入相应的限制性内切酶Kpnl和Notl， 通过这两个酶切位点，把GP5-2A-M融合基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中， 通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载体 pShutt1e-CMV-GP5-2A-M;(3) 穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M与腺病毒骨架载体pAdEasy-1的同 源重组与纯化将步骤(2)鉴定含有GP5-2A- M融合基因的穿梭载体 pShuttle-CMV-GP5-2A-M用酶切、去磷酸化后，电转化至己转入腺病毒骨架载 体pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌细胞，进行菌内同源重组；用卡那霉素筛选 获得重组病毒DNA， Pacl酶切鉴定，将其中正确的重组病毒DNA再转化XL10— Gold超级感受态细胞，以纯化重组腺病毒DNA;(4) 重组腺病毒rAd-GP5-2A- M的获得与鉴定鉴定好的重组腺病毒DNA 经过Pacl酶切线性化后，转染HEK-293A细胞内，重组腺病毒DNA在胞内包装 成完整的重组腺病毒rAd-GP5-2A- M;通过噬斑纯化后，采用RT-PCR、 IFA和 Western blot方法检测GP5-2A-M聚合蛋白的基因转录、表达及蛋白裂解；(5) 重组腺病毒的扩繁与检本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，其特征在于：该疫苗可通过在ＰＲＲＳＶ ＧＰ５和Ｍ蛋白之间插入一具有自我裂解的ＦＭＤＶ ２Ａ基因相连接，构建成ＧＰ５－２Ａ－Ｍ融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体ｐＡｄＥａｓｙ－１同源重组，将重组病毒ＤＮＡ经酶切，转染ＨＥＫ－２９３Ａ细胞后，得重组腺病毒ｒＡｄ－ＧＰ５－２Ａ－Ｍ，经腺病毒纯化、扩增等工艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘光清，云涛，倪征，余斌，陈柳，华炯钢，李双茂，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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