一种葡聚糖酶及其分离纯化的方法技术

一种葡聚糖酶及其分离纯化的方法，它涉及了一种纤维素酶及其分离纯化的方法。本发明专利技术解决了现有应用于棉织品水洗整理工艺中的纤维素酶存在应用时需要特定的酸性环境而影响产品的外观与质量的缺陷。本发明专利技术的葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适ｐＨ值为８．０，酶促反应最适温度为５５℃。本发明专利技术葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行：一、发酵粗酶液的预处理；二、柱层析；洗脱即得到葡聚糖酶。本发明专利技术的葡聚糖酶在中性或碱性的条件下保持着较高的酶活和良好的稳定性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种纤维素酶及其分离纯化的方法。
技术介绍
目前，在棉织品(牛仔服等)水洗整理工艺中广泛采用李氏木霉(7: ^0产生的纤维素酶，由于这类真菌纤维素酶制剂的适宜反应pH条件通常是酸性的，所以在水洗前要加酸将水洗液调至特定的酸性环境，操作麻烦。同时，在 酸性条件下水洗液中的染料容易玷污织物，造成"反沾色"现象，严重影响产 品的外观与质量。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有应用于棉织品水洗整理工艺中的纤维素酶存在应 用时需要特定的酸性环境而影响产品的外观与质量的缺陷，而提供一种葡聚糖 酶及其分离纯化的方法。本专利技术的葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适pH值为8.0，酶促反应最适温度为55°C ， 分子量为51.3kDa， Km值为2.1218mg/mL， Vm肪值为5.3706|xg/mL'min;其中Km值和Vn^值为葡聚糖酶降解羧甲基纤维素钠反应中的特征值。本专利技术葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行一、发酵粗酶液的预处理 将蜡样芽胞杆菌发酵60h后收集发酵液，以3000r/min的速度离心15min，取 上清液加入(NH4)2S04至(NH4)2S04的浓度为饱和度的30%，在4。C条件下以 10r/min的速度搅拌2h，静置2h，再以5000r/min的速度离心15min，取上清 液中补加(NH4)2S04至,)2804的浓度为饱和度的90%，然后再在4'C条件 下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h后，以5000r/min的速度离心15min，收 集蛋白沉淀，并用透析袋将收集的蛋白沉淀物进行脱盐，而后再进行超滤浓縮， 即得到柱层析前的酶液；二、柱层析用葡聚糖凝胶SephadexG-75进行柱层 析，洗脱液为浓度为0.02mol/L、 pH值为4.8的乙酸一乙酸钠缓冲液，洗脱液 流速为12mL/h;洗脱即得到葡聚糖酶。本专利技术的葡聚糖酶具有以下优点-1、 本专利技术的葡聚糖酶在中性或碱性的条件下、降解羧甲基纤维素钠的反 应中保持着较高的酶活和良好的稳定性这一酶学特性显示，本专利技术的葡聚糖 酶在棉织品的生物整理工业中将会克服当前使用真菌来源的葡聚糖酶带来的 不利，具有良好的应用前景。2、 本专利技术的葡聚糖酶在中性或碱性的条件下、降解羧甲基纤维素钠的反应中不但保持着高酶活和良好的稳定性，而且在表面活性剂(SDS)和螯合剂 (EDTA)存在时表现出来的显著的稳定性，说明本专利技术的葡聚糖酶能够作为 洗涤剂产品的添加剂。 附图说明图1为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶的电泳图谱，其中1号条带 为标准条带，2号和3号条带分别为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶两 个平行样的条带；图2为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶酶活随温度变 化图；图3为温度对具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶活性稳定性的影响 曲线；图4为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶酶活随pH值变化图；图 5为pH值对具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶活性稳定性的影响曲线； 图6为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶的Lineweaver-Burk作图曲线。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方 式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式的葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既 具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适pH值为8.0， 酶促反应最适温度为55°C，分子量为51.3kDa， Km值为2.12mg/mL， V臓值 为5.37pg/mL'min;其中尺m值和Kmax值为葡聚糖酶降解羧甲基纤维素钠反应 中的特征值。具体实施方式二:本实施方式葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行:一、发酵粗酶液的预处理将蜡样芽胞杆菌发酵60h后收集发酵液，以3000r/min 的速度离心15min，取上清液加入(NH4)2S04至,)2804的浓度为饱和度的 30%，在4。C条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h，再以5000r/min的速度离心15min，取上清液中补加(NH4)2S04至(NH4)2S04的浓度为饱和度的 90%,然后再在4。C条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h后，以5000r/min 的速度离心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋将收集的蛋白沉淀物进行脱盐， 而后再进行超滤浓縮，即得到柱层析前的酶液；二、柱层析用葡聚糖凝胶 SephadexG-75进行柱层析，洗脱液为浓度为0.02mol/L、 pH值为4.8的乙酸一 乙酸钠缓冲液，洗脱液流速为12mL/h;洗脱即得到葡聚糖酶。本实施方式中的饱和度为质量饱和度，步骤二中的葡聚糖凝胶S印hadex G-75的分子量为3 80kDa。将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶经过如下实验，以确定它的性质1、 将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶通过SDS-PAGE，如果出现的是 单一条带，则说明酶蛋白己经达到电泳纯，经过SDS-PAGE测定葡聚糖酶的 分子量，电泳图谱如图l所示，计算得出葡聚糖酶的分子量为51.3kDa。2、 分别以35。C、 40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C、 65°C、 70°C、 75°C 和8(TC为反应温度，于pH4.8测定本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶活， 以酶活最高者为100%计，结果如图2所示。从图2可以看出，本实施方式分 离纯化出的酶组分的活性随着温度的升高而逐渐提高，在温度达到55。C时酶 活最高，而高于此温度后，随着温度的升高，酶活急剧下降，在达到75匸时 酶活趋近于零。因此，该酶组分的酶促反应的最适温度分别为55t:。3、 在pH值为4.8的条件下，将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液 分别于35。C、 40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C、 65°C、 70°C、 75。C和80。C下 保温30min后，恢复至室温，在标准条件下，测定残存酶活力，以标准状态下 未经保温的酶活力为100%，测得结果如图3所示。从图3可以看出，在35。C 一55'C的温度范围内，本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶保持着相对稳定的酶 活性；当温度高于55'C，酶的稳定性迅速下降，当保温温度达到80。C时，酶 的活性仅为原酶活性的11.03%。因此，在55。C以下，CMCase具有良好的热 稳定性。4、 在温度5(TC条件下，将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液分别 与pH为3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0或12.0的缓冲液配制 的底物混合后，反应30min，然后分别测定在这些pH条件下本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶活，以酶活最高者为100%计，结果如图4所示。从图 4中可以看出，pH为3.0 8.0时酶的活性随pH值的增加而逐渐升高，且在pH 值在6.0-8.0的范围内提升的幅度较大'，当pH值大于8.0时，酶的活性随pH 值的增加而逐渐下降；在pH值为12.0时，酶的活性降至最低点；在pH7.0~9.0, CMCase保持着最高活性；因此，此CMCase酶促反应的最适pH为8.0。5、 将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液分别在pH为3.0、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡聚糖酶，其特征在于葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适ｐＨ值为８．０，酶促反应最适温度为５５℃，分子量为５１．３ｋＤａ，Ｋ↓［ｍ］值为２．１２ｍｇ／ｍＬ，Ｖ↓［ｍａｘ］值为５．３７μｇ／ｍＬ.ｍｉｎ；其中Ｋ↓［ｍ］值和Ｖ↓［ｍａｘ］值为葡聚糖酶降解羧甲基纤维素钠反应中的特征值。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：燕红，杨谦，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]