快速鉴定大豆疫霉β‑tubulin基因核苷酸点突变及其对噻唑菌胺抗药性的方法技术

本发明专利技术涉及大豆疫霉微管蛋白基因β‑tubulin核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂噻唑菌胺抗性监测中的应用，公开了一种鉴定大豆疫霉β‑tubulin基因23位、772位和494位核苷酸突变对噻唑菌胺产生抗药性的分子检测方法及其专用引物。所述突变位点指大豆疫霉菌中β‑tubulin基因自5'末端起第23位、772位和494位核苷酸分别为纯合T、G和A以及β‑tubulin蛋白自N端起第8位、258位和165位氨基酸为纯合的亮氨酸、缬氨酸和酪氨酸。该检测方法，灵敏度高，稳定性好，可用于高通量地监测田间大豆疫霉对噻唑菌胺的抗性发生和发展情况，实现抗性病害的早期预警，指导合理用药，延缓抗药性的发生和发展。

And the methods of thiazole resistant bacteria amine for rapid identification of Phytophthora beta tubulin gene mutation at nucleotide

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定大豆疫霉β-tubulin基因核苷酸点突变及其对噻唑菌胺抗药性的方法
本专利技术涉及一种鉴定大豆疫霉微管蛋白β-tubulin基因核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂噻唑菌胺抗性检测中的应用，具体公开一种快速鉴定大豆疫霉β-tubulin基因核苷酸点突变及其对噻唑菌胺抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学

技术介绍
大豆疫霉(Phytophthorasojae)是十大植物病原卵菌之一，有性生殖方式为同宗配合。其寄主范围单一，主要侵染大豆，引起大豆根腐病。该病是大豆生产上的重要病害之一，严重时导致绝产。该病于1948年在美国的印第安纳州首次发现，以后迅速扩展到加拿大、巴西、阿根廷及欧洲、非洲的一些国家，目前已遍布于世界各大豆主产区，每年造成数十亿美元的经济损失。目前，化学防治以其速效和高效的特点，在大豆疫霉等植物病原卵菌病害的防治中依然发挥着不可替代的作用。但是随着一些内吸性杀菌剂的不合理频繁使用，许多植物病原卵菌已经对其产生了严重的抗药性。因此，国际上各大农化公司一直致力于开发具有新作用机制且与市场上现有杀菌剂无交互抗药性的新型杀菌剂，用于大豆疫霉等植物病原卵菌病害的防治和抗药性治理。噻唑菌胺(ethaboxam)是韩国LG生命科学公司(原LG化学有限公司)开发的噻唑酰胺类杀菌剂，其商品名Guardian。1998年，噻唑菌胺首先在韩国获准登记为新颖杀菌剂。噻唑菌胺是一种内吸性的杀菌剂，具有保护和治疗活性，主要防治对象为植物病原卵菌。研究发现噻唑菌胺对病菌微管有一定的破坏作用，它能够影响微管的完整性，推测其为微管蛋白抑制剂。目前，噻唑菌胺正在全球不同地区申请登记用于防治大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌，黄瓜霜霉病菌及葡萄霜霉病菌等植物病原卵菌的防治，具有广阔的应用前景。但是，本研究室通过药剂驯化的方法得到了对噻唑菌胺分别产生低抗和高抗性水平的大豆疫霉菌株，并且抗性菌株具有一定的生存适合度，表明具有低到中等的抗性风险。因此，在使用噻唑菌胺防治植物病原卵菌病害时需要关注并避免抗药性的产生，加强检测和早期预警病原菌对噻唑菌胺的抗性发生发展情况，这有助于指导噻唑菌胺的科学使用，延缓抗药性的发生和发展，延长药剂的使用年限。杀菌剂抗性常规检测方法包括：菌丝生长速率法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法和琼脂展布法等。但是这些方法都需要先分离并纯化病原菌，然后接种于带药培养基上或接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，一定时间之后才能调查结果。采用常规的方法，当田间抗药性菌株的频率>1％时，才能被检测到(如有95％的概率检测到1％频率的抗药性菌株，检测的样本量需大于300)，因此具有灵敏度低，工作量大，试验周期长等缺点。随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，等位特异PCR分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测频率在10-5～10-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。因此，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测或辅助检测大豆疫霉菌中β-tubulin基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。本专利技术所提供的一种检测或辅助检测大豆疫霉菌中β-tubulin基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：以待测大豆疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4以及SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出354bp、244bp和284bp三条带中的任意一条带，则所述待测大豆疫霉菌中β-tubulin基因存在突变位点；所述突变位点指大豆疫霉菌中β-tubulin基因的基因组序列自5'末端起第23位核苷酸为T纯合，第772位核苷酸为G纯合和第494位核苷酸为A纯合。所述大豆疫霉菌中β-tubulin基因的基因组序列自5'末端起第23位核苷酸也就是SEQIDNO：8中自5'末端起第23位核苷酸；自5'末端起第772位核苷酸也就是SEQIDNO：10中自5'末端起第772位核苷酸；自5'末端起第494位核苷酸也就是SEQIDNO：12中自5'末端起第494位核苷酸。上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度分别为66.7℃，66.7℃和68.1℃。本专利技术所提供的检测或辅助检测大豆疫霉菌中β-tubulin基因是否存在突变的引物对，由SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4以及SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示DNA分子组成。本专利技术的另一个目的是提供大豆疫霉菌中β-tubulin基因或蛋白的突变位点。本专利技术所提供的大豆疫霉菌中β-tubulin基因的三个突变位点，为大豆疫霉菌中β-tubulin基因的基因组序列自5'末端起第23位核苷酸为T纯合，第772位核苷酸为G纯合和第494位核苷酸为A纯合。其中，大豆疫霉菌中β-tubulin基因的基因组序列自5'末端起第23位核苷酸也就是SEQIDNO：8中自5'末端起第23位核苷酸；自5'末端起第772位核苷酸也就是SEQIDNO：10中自5'末端起第772位核苷酸；自5'末端起第494位核苷酸也就是SEQIDNO：12中自5'末端起第494位核苷酸。本专利技术所提供的大豆疫霉菌中β-tubulin蛋白的三个突变位点，为大豆疫霉菌中β-tubulin蛋白的自N端起第8位氨基酸为纯合的亮氨酸，第258位氨基酸为纯合的缬氨酸和第165位氨基酸为纯合的酪氨酸。其中，所述的大豆疫霉菌中β-tubulin蛋白的自N端起第8位氨基酸也就是SEQIDNO：7中自N端起第8位氨基酸；自N端起第268位氨基酸也就是SEQIDNO：9中自N端起第268位氨基酸；自N端起第165位氨基酸也就是SEQIDNO：11中自N端起第165位氨基酸。上述任一所述突变位点在鉴定大豆疫霉菌抗药性中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述抗药性为抗噻唑菌胺等噻唑酰胺类杀菌剂。上述应用中，存在所述突变位点的大豆疫霉菌具有抗药性。本专利技术提供的检测大豆疫霉菌对噻唑菌胺产生抗药性的点突变的方法，对抗性菌株进行高灵敏度、简单快速的分子检测，及时了解抗药性发生动态，对制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。附图说明图1为大豆疫霉菌敏感和抗性菌株的序列对比。A，C，E：大豆疫霉菌β-tubulin基因的突变情况；B：大豆疫霉菌β-tubulin基因第23位的纯合T碱基；D：大豆疫霉菌β-tubulin基因第772位的纯合G碱基；F：大豆疫霉菌β-tubulin基因第494位的纯合A碱基。PSDZT2-14，Ps6和P6497为敏感菌株。R40，R41，R42，R7，R14，R15，R25，R53和R68为抗性菌株。图2为AS-PCR检测大豆疫霉菌抗性突变体。A：三对AS-PCR引物在不同温度条件下的电泳结果。B：引物PSLR23F/R在66.7℃下的扩增结果。C：引物PSLR772F/R在66.7℃下的扩增结果。D：引物PSHR494F/R在68.1℃下的扩增结果。S为敏感菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测或辅助检测大豆疫霉菌中β‑tubulin基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：以待测大豆疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物对分别进行PCR扩增，若分别能扩增出354bp，244bp和284bp条带，则所述待测大豆疫霉菌中β‑tubulin基因存在突变位点；所述PCR扩增中，退火温度分别为66.7℃，66.7℃和68.1℃；所述突变位点指大豆疫霉菌中β‑tubulin基因的基因组序列自5'末端起第23位核苷酸为T纯合，第772位核苷酸为G纯合和第494位核苷酸为A纯合；由此分别导致大豆疫霉β‑tubulin蛋白自N端起第8位氨基酸为纯合的亮氨酸，第258位氨基酸为纯合的缬氨酸和第165位氨基酸为纯合的酪氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种检测或辅助检测大豆疫霉菌中β-tubulin基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：以待测大豆疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4以及SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示引物对分别进行PCR扩增，若分别能扩增出354bp，244bp和284bp条带，则所述待测大豆疫霉菌中β-tubulin基因存在突变位点；所述PCR扩增中，退火温度分别为66.7℃，66.7℃和68.1℃；所述突变位点指大豆疫霉菌中β-tubulin基因的基因组序列自5'末端起第23位核苷酸为T纯合，第772位核苷酸为G纯合和第494位核苷酸为A纯合；由此分别导致大豆疫霉β-tubulin蛋白自N端起第8位氨基酸为纯合的亮氨酸，第2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘西莉，彭钦，方媛，王治文，刘莹，刘鹏飞，黄中乔，薛昭霖，李腾蛟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11