野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因的检测引物制造技术

本发明专利技术提供了一种基于qRT‑PCR鉴定野生稻响应稻褐飞虱取食后体内激素信号相关基因转录量变化的若干引物序列，该引物跨基因内含子设计，确保只扩增野生稻cDNA上的相应序列。利用本发明专利技术提供的特异性、跨内含子的引物可实现对野生稻响应稻褐飞虱取食后激素信号相关基因转录水平变化的准确检测，可有效去除核基因扩增的污染，为野生稻响应稻褐飞虱取食的分子机理研究提供了可靠的方法。

Detection of hormone signal related genes in wild rice response to rice brown planthopper feeding in vivo

【技术实现步骤摘要】
野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因的检测引物
本专利技术属于生物技术检测领域，尤其涉及野生稻经稻褐飞虱取食后体内激素信号相关基因转录水平的检测。
技术介绍
稻褐飞虱(NilaparvatalugensStal.)属同翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)昆虫，是我国和亚洲水稻生产中的主要害虫。褐飞虱危害水稻途径可分为二个方面，直接危害和间接危害。直接危害是褐飞虱成虫、若虫直接吸食水稻造成的危害，在稻丛下部刺吸汁液，消耗稻株养分。研究发现，水稻受褐飞虱取食后，组织中化学成分改变，叶绿素、可溶蛋白含量、蛋白酶活性和水分均降低，严重时水稻倒伏、枯萎，造成减产。间接危害是褐飞虱产卵刺伤植物组织以及传播或诱发水稻其他病害的发生。如何防止褐飞虱的大规模爆发和提高栽培稻在逆境胁迫下的产量和质量，一直是科研工作者的研究目标。杀虫剂技术难度大、成本高且污染环境，所以研究水稻抗虫的分子机理，筛选克隆抗性基因，改良栽培稻品种，是提高水稻抗虫十分必要的方法。在自然环境中，植物持续暴露于各种非生物和生物胁迫中。为了生存，植物进化出了错综复杂的机制来感知外界信号，并选择最优的应对方式。当植物感知到这些胁迫后，体内的激素、活性氧、激酶和相关的转录因子会相互配合组成响应的网络，来帮助植物应对这些外界的胁迫。昆虫取食植物诱导植物细胞里发生一系列分子事件，转换成警报信号，然后产生并富集一些防御性的代谢产物。植物对昆虫取食的诱导型防御分为三个阶段，感知阶段、信号传递阶段和代谢产物的生物合成阶段。一些小分子和蛋白已被发现并认为在抗虫防御信号传递阶段起重要作用，包括Ca2+、蛋白激酶(MAPKs)、活性氧族(ROS)和植物激素。植物激素在植物响应外界胁迫的传递网络中扮演着至关重要的角色，这些激素信号错综复杂、相互协同或拮抗，共同调节植物对外界环境的应答。参与抵御生物胁迫的激素主要包括水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)。
技术实现思路
结合目前研究和前期工作，本专利技术人在两种野生稻中利用数字表达分析谱筛选了经褐飞虱取食后，转录水平变化显著且与激素信号途径相关的基因。使用qRT-PCR方法检测这些基因在两种野生水稻中的相对转录量，为进一步研究水稻抗虫的分子机理和野生稻资源开发利用提供依据。本专利技术的目的是提供引物用于检测经稻褐飞虱取食后野生稻体内激素信号相关基因转录水平的变化，本专利技术引物跨内含子设计，特异性高，可消除基因组扩增的影响，使用qRT-PCR技术进行野生稻体内激素信号相关基因的转录水平检测。本专利技术所提供的的技术方案是：一种检测野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因转录水平的方法，其特征在于：所述相关基因为基因ERF1(ethylene-responsivetranscriptionfactor1)、GID1(gibberellinreceptor)、DELLA(asparticacid–glutamicacid–leucine–leucine–alanine)、PBS1(serine/threonine-proteinkinase)、CALM(calmodulin)、TGA(transcriptionfactorTGA)、BAS1(PHYBactivationtaggedsuppressor1)、或/和ARF(auxinresponsefactor)，该方法是提取待测野生稻叶片总RNA，以所述相关基因的特异性引物对待测样品进行qRT-PCR检测，所述特异性引物如下：进一步地，所述的检测方法，所述引物的用量及退火温度如下：上述的检测方法，qRT-PCR检测反应体系如下：PCR反应体积20μL，体系包含2×SYBRPremixExTaqTM(TAKARA)10μL，引物量如权利要求2所述，cDNA2μL，余量为水；扩增程序：95℃变性2min；95℃变性15s，退火30s，72℃延伸20s，进行40个循环。本专利技术还提供检测野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因转录水平的引物，所述引物如下：本专利技术中选择的基因均为野生稻响应稻飞虱取食后，数字表达分析谱中转录水平变化特别显著的基因，这些基因与野生稻抗虫性密切相关。为准确检测这些基因在转录水平的变化，本专利技术引物严格跨基因内含子设计，保证只扩增cDNA序列，避免核基因组扩增污染。正、反向引物之间尽量避免产生发夹结构、引物二聚体和错配，退火温度选择在57℃-60℃之间，扩增序列长度在100bp-150bp之间。本专利技术中的九对引物可对与野生稻抗虫相关的基因进行转录水平检测，可应用于检测水稻内抗虫相关基因，引物适用于一般的qRT-PCR检测，特异性高、可重复性好、操作简单。附图说明图1是实施例1qRT-PCR检测曲线，箭头1-4指示两种野生稻经褐飞虱取食(72h)和不放虫对照(72h)的扩增曲线，箭头5指示阴性对照(无模板)。图2是实施例1所述的野生稻(DX和CL)经褐飞虱取食(Infestation)和不放虫对照(CK)的相关基因相对转录量的比较。其中“*”为P<0.05、“**”为P<0.01、“***”为P<0.001。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。实施例1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料本实施例中所选材料的具体名称及材料来源见表1，用于实验的植物材料为新鲜的叶片。表1植物材料及来源1.1.2稻褐飞虱由华中农业大学吴刚老师提供。1.1.3试剂野生稻RNA提取所用试剂购自天根生化科技(北京)有限公司，反转录和qRT-PCR所用试剂购自宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2方法1.2.1稻褐飞虱取食将种子萌发后的野生稻幼苗移栽至塑料盆(0.3m长×0.3m宽×0.5m高)，每个塑料盆里种植4株野生稻幼苗。然后在盆外套防笼网(0.5m长×0.5m宽×1.0m高)。野生稻幼苗长有3-4片真叶时，往防虫笼里放稻褐飞虱，每株野生稻幼苗施放4只。不放稻褐飞虱作为对照。褐飞虱施放72小时后，收集野生稻叶片，迅速放入液氮中保存。1.2.2RNA提取将新鲜的植物叶片(约100mg)迅速放入加有液氮的研钵中研磨,研磨至粉末后放入离心管。按照天根RNAprepPure植物总RNA提取试剂盒提取叶片总RNA。1.2.3反转录检测总RNA浓度，使用PrimeScriptTMRTMasterMix(TAKARA)试剂盒反转录成cDNA。1.2.4qRT-PCR检测反应体系PCR反应体积20μL，体系包含2×SYBRPremixExTaqTM(TAKARA)10μL，引物量见表2，cDNA2μL，余量为水。扩增程序：95℃变性2min；95℃变性15s，退火(各引物退火温度见表2)30s，72℃延伸20s(进行40个循环)。表-2引物信息引物名称引物量退火温度扩增产物长度AK1059400.1μL60℃121bpAK0738120.05μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因转录水平的方法，其特征在于：所述相关基因为基因ERF1、GID1、DELLA、PBS1、CALM、TGA、BAS1、或/和ARF，该方法是提取待测野生稻叶片总RNA，以所述相关基因的特异性引物对待测样品进行qRT‑PCR检测，所述特异性引物如下：

【技术特征摘要】
1.一种检测野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因转录水平的方法，其特征在于：所述相关基因为基因ERF1、GID1、DELLA、PBS1、CALM、TGA、BAS1、或/和ARF，该方法是提取待测野生稻叶片总RNA，以所述相关基因的特异性引物对待测样品进行qRT-PCR检测，所述特异性引物如下：2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述引物的用量及退火温度如下：3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇波，刘方，李俊生，徐晗，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11