本发明专利技术提供了一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。所述方法为：将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞缺氧培养２０～３０小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植。本发明专利技术的有益效果主要体现在：通过缺氧培养，可有效提高人骨髓间充质干细胞的旁分泌能力，能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，促红细胞生成素及其受体，进而提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，以 提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。(二)
技术介绍
细胞移植治疗修复组织损伤是目前新兴的医疗领域热点。细胞疗法是 对传统医学的一种补充手段，为某些难治性疾病的治疗提供新的希望。干 细胞是一种能自我复制无限增殖，在特定的诱导条件下向同胚层或其他胚 层细胞分化的祖细胞。#4居不同组织来源，干细胞可分为胚胎干细胞和成 体干细胞，后者分布于大部分组织中。由于成体干细胞移植无伦理学问题 和致瘤性，更适合于基因和细胞工程的"种子细胞"。间充质干细胞来源于 中胚层细胞。可从很多组织分离获得，如肝脏、胎儿和脐带血、羊水和脂 肪组织，但研究最多和最易得到的是骨髓(在全部骨髓单个核细胞占<0.01%)。人骨髓间充质干细胞的鉴定主要包括:①在正常体外培养条件贴壁生 长，呈长梭形或三角形；②流式细胞学^r测95%以上的骨髓间充质干细 胞表达CD105、CD73和CD卯，且不表达CD45，CD34，CD14(或CDllb)， CD19 (或CD79-a),人白细胞抗原HLA-DR表面分子(小于2 %阳性表 达率)；③具有多分化潜能。大量动物实验显示骨髓间充质干细胞在修复 组织损伤中有其独特的优势和良好的安全性，且人骨髓间充质干细胞移植 能显著改善急性心肌梗死后心功能和延緩心室重构。进一步研究发现，移 植的人骨髓间充质干细胞直接分化为心肌样细胞、血管内皮细胞和平滑肌 细胞，参与新生血管形成，更重要的是移植细胞通过旁分泌大量的细胞因子和生长因子，抗细胞凋亡和促血管新生，增加移植细胞的存活率。有研 究认为，骨髓干细胞移植后能在局部存活增殖的仅占移植细胞的1/3，因 为提高移植细胞在局部组织的存活率和旁分泌能力势必能提高细胞移植 的疗效。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理 方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。本专利技术采用的技术方案是，所述方法为将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞缺氧培养20 30小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植。所述缺氧培养是指在没有氧气存在下进行培养，可在氮气、二氧化碳或者氮气与二氧化碳混合气的氛围下进行培养，除了气体氛围与常规培养不同外，其他培养条件均可参照常规人骨髓间充质干细胞的体外培养条件进行。缺氧预处理能激发细胞内源性保护机制，启动某些基因的表达和应激蛋白的合成，增强细胞抗缺氧能力。研究发现，缺氧预处理(亚致死量)能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，包括缺氧诱导因子-la(HIF-la),血管合成素-1,血管内皮细胞因子受体Flk-l，促红细胞生成素及其受体。缺氧预处理能诱导骨髓间充质干细胞表达促生存蛋白P105、 NF-kB亚单位P65和P50,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。缺氧预处理的骨髓间充质干细胞移植到急性心肌梗死局部能减少移植细胞和心肌细胞的凋亡，促进更多的血管新生，缩小心月几梗死面积和改善心功能。具体的，所述方法为在细胞移植前，将将继代第3代的人骨髓间充质干细胞于37。C下在低糖DMEM培养基中缺氧培养20 30小时后，恢复 37。C常氧培养2小时以上(通常培养24小时细胞较为稳定)，获得处理后 的人骨髓间充质干细胞用于细胞移植。具体的，所述缺氧培养为在(302体积浓度5%、 N2体积浓度95。/。 的混合气体中培养。所述常氧培养为在C02体积浓度5。/。、 02体积浓度 95%的混合气体中培养。具体的，所述方法如下在细胞移植前，将人骨髓间充质干细胞于 37。C下、在(302体积浓度5%、 N2体积浓度95%的混合气体中，于低糖 DMEM培养基中缺氧培养24小时后，恢复37。C常氧培养24小时，获得 处理后的人骨髓间充质干细胞再进行细胞移植。为提高人骨髓间充质干细 胞旁分泌能力，该步骤操作可重复进行。本专利技术的有益效果主要体现在通过缺氧培养，可有效提高人骨髓间 充质干细胞的旁分泌能力，能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长 因子和促血管生长因子，促红细胞生成素及其受体，进而提高人骨髓间充 质干细胞移植修复组织损伤的疗效。附图说明图1为细胞在不同氧浓度下培养示意图；l为压缩空气瓶，2为C02瓶，3为N2瓶，4为氧气探测监控装置，5为细胞培养箱，6为气体阀门；图2为相差显微镜下人骨髓间充质干细胞形态学表现；图3为缺氧培养刺激人骨髓间充质干细胞成倍分泌细胞生长因子和促血管生长因子；图4为缺氧培养诱导人骨髓间充质干细胞表达促生存蛋白P105、 NF-kB 亚单位P65和P50，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL,降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一 步描述,但本专利技术的保护范围 并不仅限于此实施例1:1. 无菌条件下从合适的成年患者(排除造血系统疾患)的髂后上棘抽取 骨髓液30~50ml,放置于预先添加4000IU肝素的无菌玻璃瓶中，充分 混匀避免骨髓液凝固，移至层流室生物安全拒进行下一步操作。2. 将等量低糖DMEM培养基(添加100U/ml青霉素和100U/ml链霉素， 购自美国GIBCO公司)加入放置骨髓液的无菌玻璃瓶中稀释骨髓液， 用无菌移液器充分吹散骨髓细胞。3. 按照密度梯度分离法分离骨髓单个核细胞。在50ml无菌离心管中加入 20ml淋巴细胞分离液(密度是1.077±0.001 g/ml，购自上海恒信化学试 剂有限公司)，将20ml骨髓液轻轻叠加在淋巴细胞分离液表面。在高 速低温离心机中(Heraeus D-37520,购自德国Thermo Electron /〉司) 以4。C条件下900g离心25分钟。离心完毕后，细胞分层，从下至下， 可见培养基、白膜层、淋巴分离液和红细胞层。用lml无菌移液器收 集中间白膜层细胞于另一 50ml离心管中，然后加入20ml低糖DMEM 培养基，漂洗细胞表面残留淋巴分离液。于4。C条件下900g离心10 分钟，弃上清，收集骨髓单个核细胞。以含10%胎牛血清(购自美国 GIBCO公司)的低糖DMEM培养基重悬沉淀细胞，按2xl05 /cm2细 胞密度接种至75cm2生长面积的细胞培养瓶(购自美国Corning公司)，放置于37。C,含5。/。C02和饱和湿度的细胞培养箱(Forma3111，购自 美国Thermo Fisher公司)中(参见图1)，静置48小时后首次换液， 以去除不贴壁细胞。此后每4 5天换液一次，长满80%~90%以上传代。4. 以含10%胎牛血清低糖DMEM培养基进行原代和继代细胞培养，放 置于37。C、 一定湿度的含5% C02的混合气体中常氧培养，根据骨髓 间充质干细胞贴壁生长的特性，每4 5天更换细胞培养基，去除非贴 壁细胞，不断纯化人骨髓间充质干细胞。继代第3代时细胞可进行形 态学、流式细胞学等细胞鉴定。5. 将正常氧浓度下培养的继代第3代人骨髓间充质干细胞移至缺氧培养 箱中进行缺氧预处理。缺氧培养前细胞生长达约80%融合，细胞更换 低糖DMEM培养基。于37°C、饱和湿度的含5% (v/v) 002和95%(v/v) N2混合气体中缺氧培养，缺氧处理在一个能精确调控氧浓度的 ProOx-C-cha本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，所述方法包括：将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞缺氧培养２０～３０小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建安，谢小洁，胡新央，刘先宝，蒋峻，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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