一种泡桐肉桂酰ＣｏＡ还原酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种泡桐肉桂酰ＣｏＡ还原酶基因及其应用。该泡桐肉桂酰ＣｏＡ还原酶氨基酸残基序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１所示。利用这些信息可以构建成肉桂酰ＣｏＡ还原酶基因、该基因的反义基因、或ＲＮＡ干扰体，用于植物材质改良，可以建立起木质素含量高、或低的新种质材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肉桂酰CoA还原酶(cinnamoyl CoA reductase CCR)基因 及其应用，属于生物工程领域，特别涉及到泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属 (Paulownia)白花泡桐〔Paulownia. fortunei (Seem)Hemsl 〕)编码CCR基因及其 应用。
技术介绍
1、关于泡桐及其泡桐木材的材质改良泡桐(Paulownia)为泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)落叶乔木， 原产我国，除个别种分布到越南、老挝 外，其他各种均为我国所特有。泡桐是世界三大优质、速生用材树种之一，分布范围很广，二十三个省、 市、自治区都有。不少地区作为四旁植树、农桐间作、林网建设的主要树种； 有些地方还逐渐向山地造林发展，栽培量很大，仅河南省栽植的泡桐就达二亿 株左右。泡桐生长快，如果管理得好，泡桐五六年即可成材。泡桐材质轻，纹 理鲜明美观，易干燥，易加工、不翘、不裂、不易变形、不易燃烧，绝缘性好， 耐酸耐腐，防湿隔热，导音性能好等优点，是单板与人造板生产的重要原料； 特别适合制作航空、舰船模型、救生器械及乐器及家具制作等，不但用于工农 业及日常生活等各个方面，而且也是我国传统的出口物资，在我国林业生产中 占有特殊地位。但是应该看到，泡桐木材材质的另一面轻(容重低)，强度与硬度低，严重限制了它在建筑、交通、家装、家具、造纸等方面的应用范围与应用价值。 因此，改良泡桐的材质，提高其强度与硬度，拓宽其应用范围具有重大的应用 与经济价值。泡桐的材质改良有两个方向。一是提高其强度与硬度，拓宽其木材建筑、 交通、家装与家具等方面的应用；二是提高木材中纤维素的含量，降低其木质 素的比率，以提高纸浆的产量、降低对环境的污染，更适用于造纸。2、关于木材的材质改良肉桂酰CoA还原酶基因的关系我们知道木材的材质或特性主要是由木纤维的基本组分--木质素、纤维素 的单体种类、性质及其比率与总量决定的。纤维素约占木材干重的40 50%，木 质素约占15 36%， 二者总计占到木材总中的70%以上，且二者均直接或间接来 源于光合作用产生的光合产物。纤维素是纤维素则是木材中的骨架、韧性成分，是由葡萄糖组成的大分子 多糖。木质素是由对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇四种醇单体形成 的一种复杂酚类聚合物。木质素是木材细胞间的粘合剂、刚性原料和保持性物 质。木质素生物合成是一个极其复杂过程，涉及苯丙氨酸裂解酶 (Phenylalanine ammonialyase PAL) 、 4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate : CoA ligase 4CL)、肉桂酰CoA还原酶(cinnamoyl-CoA reductase CCR)等 多个基因。这些基因的功能、作用不同，并分处在木质素生物合成的源头、中、 下游不同位置，其中PAL是位于源头的第一个酶，处于最高端；4CL位于中游， 而CCR则处于较下游的位置。这些酶中的任何一种酶，都不能缺失、不能替代； 任一种酶的失常都将影响木质素的合成，导致材质的变化，且影响的范围、形式与结果不同。木材材质改良的实质，就是通过改变木质素、纤维素生物合成关键酶基因， 调控木质素、纤维素单体种类、性质及其比率与总量。CCR是木质素特异途径的第一个关键酶，催化羟基肉桂酰-辅酶A硫酯还原成 相应的肉桂醛，是木质素合成途径的碳向木质素分配的控制关节点，对木质素 单体的生物合成起着重要作用。增强CCR基因的表达，提高CCR酶的活性，可以提高木质素在木材中的比 率，可以提高其强度与硬度；反之，沉默或抑制CCR基因，会降低其在木材中 的比率，提高纤维素的比率，用于造纸则可提高纸浆的产量，降低木质素对环 境的污染。
技术实现思路
本专利技术提供了一种来源于泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)白 花泡桐(Paulownia fortunei (Seem.)Hemsi)的肉桂酰CoA还原酶基因序列及 其相应的氨基酸序列。提供了含有CCR的克隆载体PUc 19 / CCR和含有这种 载体的E .coli细胞JM109 / pUC19 /CCR 。泡桐CCR的DNA序列或其片段通常可以依据本专利技术提供的mRNA、氨基酸序 列信息资料以PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法， 可根据本专利技术所公开的有关核昔酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物， 按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关 序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增 出的片段按正确次序拼接在一起。获得有关的序列后，用重组法来大批量地获 得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成 有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核昔酸小片段，然后再进行连接而获得编码本专利技术CCR基因的核昔酸序列。然后，可将该 核昔酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。利用本专利技术成果，可以构建CCR基因工程菌，用于植物的基因转化，达到 改良植物品质或材质的目的。本专利技术中CCR基因的克隆，采用的技术方案是基于基因的同源性，利用简 并寡核苷酸引物的RT-PCR法，以白花泡桐RNA为模板，首先用简并引物引物， 通过RT-PCR的方法，得到了 CCR基因的部分cDNA片段。然后，据此片段提供 的cDNA序列信息，设计了2条反向嵌套式引物与2条正向嵌套式引物，用RACE 方法获得了未知的5'和3'端基因片段。最后，将获得的3条cDNA序列进行 拼接，获得了白花泡桐CCR全长cDNA序列。将获得的4CL基因片段与和专用的 克隆载体pMD19-T连接，获得pMD19-T-CCR质粒。利用热激法将这一质粒导入 感受态E. coli细胞JM109，成为含有pMD19-T-CCR的大肠杆菌细胞JM109 / pMD19-T-CCR。白花泡桐CCR基因全长cDNA序列已在GenBanK数据库注册，注 册号为EU338487，见SEQ ID No:2。CCR基因全长1243bp， CDS 999(103-1101),起始密码子ATG位于103-105bp 处，终止密码子TAG位于1099-1101bp处；推测共编码332个氨基酸，见SEQ ID No:l。通过GenBanKBLAST比对的结果，显示泡桐与山杨(Populus trichocarpa) CCR基因编码序列的同源性为79%。泡桐与山杨CCR酶氨基酸序列(CAC07424. 11) 同源性为84%。含有本专利技术基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的效果和益处在于该CCR是首次被提取、克隆和测序的白花泡桐 〔Paulowniafortunei(Seem. )Hemsi〕 CCR基因。该基因编码的CCR参与、影响 植物木质素合成代谢过程，所以该基因的克隆可用于构建表达CCR的基因的表 达载体及其工程菌。将该基因转入植物体并使之整合于植物的基因组，将严重 影响其木质素、纤维素的合成、代谢的过程与结果，达到改良陆生植物，特别是用材林木树种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种泡桐肉桂酰ＣｏＡ还原酶编码蛋白，其氨基酸残基序列如ＳＥＱ　ＩＤ　№：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌民，叶金山，刘志刚，刘双绂，王军军，李荣幸，杨艳坤，陈占宽，
申请(专利权)人：河南省绿士达林业新技术研究所，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]