一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人干扰素α２ｂ基因的可溶性表达载体ｐＢＰＥ１７２－α２ｂ的构建方法，构建方法为：（１）根据大肠杆菌ＥｃｏｌＣ１９５８基因序列，设计引物扩增得到产物ＥｃｏｌＣ１９５８，双酶切质粒ｐＥＴ２８ａ和扩增产物ＥｃｏｌＣ１９５８，连接，构建出载体ｐＢＰＥ１７２；（２）将重组人干扰素α２ｂ的核苷酸序列与载体ｐＢＰＥ１７２酶切后连接，得到一种重组人干扰素α２ｂ基因的可溶性表达载体ｐＢＰＥ１７２－α２ｂ。本发明专利技术构建的载体转化大肠杆菌Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＢＬ２１，诱导表达时，表达出的干扰素α２ｂ主要在上清中存在，说明干扰素α２ｂ是以可溶性的形式存在，利用本载体制备的干扰素的溶解性得到了很大的提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物工程
，涉及一种表达载体的构建方法。
技术介绍
重组人干扰素是分子生物学发展的产物，人们可以按其意向设计出不同于自然人干扰 素的新型干扰素。通过遗传点突变技术，研制出具有独特功能的干扰素和干扰素融合体。 这些干扰素类似物和杂合体有希望成为活性更强、更适于临床应用的新型干扰素。目前市 场上应用最多的干扰素是基因工程重组干扰素a2b，它是采用基因工程技术，特别是DNA 重组技术制备，利用基因工程技术获得干扰素基因，将其连接质粒上然后重组到表达细胞 中进行转录、翻译、表达，最后纯化得到高浓度的干扰素产品，但是存在的问题是干扰素 在溶解性不够理想，于是越来越多的研究者将研究方向的重点放在如何在分子水平上改造 干扰素基因使其溶解性得到提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组人干扰素a2b基因的可溶性表达载体pBPE172-a2b的构 建方法，通过构建出的表达载体可使表达出的重组人干扰素a2b成为可溶性。 本专利技术的技术方案概述如下一种重组人干扰素a2b基因的可溶性表达载体pBPE172-a2b的构建方法，由如下步骤组成(1) 根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计引物扩增得到产物EcolC1958，用XbaI 和EcoRI双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，连接，构建出载体pBPE172，所述载 体pBPE172中包含一段rbs序列AAAGGAGGAGAATATACATT;(2) 将序列表SEQ ID NO. 3所述的重组人干扰素a 2b的核苷酸序列与所述载体pBPE172 酶切后连接，得到一种重组人干扰素a 21^基因的可溶性表达载体。8 ￡172- a 2b。本专利技术的优点是本专利技术构建的重组人干扰素a2b基因的可溶性表达载体pBPE172-a2b转化大肠杆菌 E.ColiBL21，诱导表.达时，表达出的干扰素a2b主要在上清中存在，说明干扰素a2b是以 可溶性的形式存在，利用本载体制备的干扰素的溶解性得到了很大的提高。 附图说明图1为PCR后的EcolC1958片段的琼脂糖电泳图。图2为pBPE172质粒双酶切凝胶电泳图。图3为重组人干扰素a 2b片段的琼脂糖电泳图。图4为pBPEl72- a 2b质粒双酶切的凝胶电泳图。图5为表达质粒pBPE172- a 2b诱导表达SDS-PAGE电泳图。图6为pBPE172载体的构建示意图。图7为pBPEl 72- a 2b构建示意图。 '具体实施例方式pfuDNA聚合酶，dNTPmixture ， Tris饱和酚、蛋白胨、酵母粉、琼脂糖、丙烯酰胺、 甲叉双丙烯酰胺、e-巯基乙醇、十二垸基硫酸钠(SDS)、卡那霉素、氯霉素购于北京鼎国 生物技术有限责任公司。标准核酸分子量Marker DL 2000， Hind III酶，EcoR I酶，Xbal酶，HindIII酶DNA Ligation Kit Ver 2.0连接酶等购于宝生物工程(大连)有限公司。PCR产物纯化试剂盒，EZ-10 Spin Column PCR Product Purification Kit Cat.No.BS363与物技术有限公司。 -下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。 实施例1可溶性表达载体pBPE172的构建1) 通过National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库检索铁氧还蛋白 EcolC1958的DAN原始序列(约2000bp)，利用primer premier 5.00设计引物1和引物2。 引物1和引物2构成一对引物，包含与EcolC1958连接片段互补的DNA序列。其中，引物 1包含酶切位点Xbal和一段特殊的rbs序列(此序列能够更加有利于核糖体与mRNA的结 合)，引物2包含酶切位点EcoRI。引物 1的序歹iJ (波浪线为酶切位点，直线为rbs序歹U ):所述的核苷酸序列)引物2的序列(波浪线为酶切位点)CTCGAATTCCACAGGCAGTAGATT (序列表SEQ IDNO.2所述的核苷酸序列)2) 铁氧还蛋白EcolC1958 DNA片段的扩增。PCR反应体系(100uL体系)如下10 X PCR Buffer (含Mg2+ 15mM)lOuLdNTP (各2.5mM)lOuLDMSOlOpL引物l (20ng/uL)2uL引物2 (20ng/wL)2uL模板DNA (大肠杆菌DNA) (10ng/yL)2uL超纯水63 u Lpfu酶(5U/uL)1 u LPCR反应条件95°C， 5min, 1个循环；95°C， 40s， 50°C， 30s， 72°C， 3min30s， 共 30个循环；72°C， 10min， 1个循环；4'C保存。得到铁氧还蛋白EcolC1958 DNA片段。电泳验证，(见图1，泳道1为2000bp左右)， 纯化，4'C保存。3)用内切酶Xbal和内切酶EcoRI，双酶切铁氧还蛋白EcolC1958 DNA片段和质粒 pET28a，形成单链带有突出端的待连接片段。 酶切体系(10uL体系)10XM Buffer luLEcolC1958或pET28a 5uL超纯水 3 u LXbal 0.5pLEcoRI 0.5nL于37i:恒温箱中，2h。得到单链带有突出端的待连接片段EcolC1958和pET28a线性 片段。4)DNA片段的连接。连接体系2 X Ligation Buffer 5yLEcolC1958 2.5 uLpET28a 2.5jxLT4连接酶 0.5 uL于24'C恒温水浴中，2h 。得到连接产物。5)将连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min， 42。C水浴热击 90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入400^1 LB液体培养基(不含Amp)， 37'C摇床 静置50min， 5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200nl,均匀涂 布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37'C培养过夜，第二天挑单菌落，用碱法提取质 粒进行双酶切验证，最后经测序正确即为载体pBPE172。见图2，pBPE172质粒双酶切凝胶电泳图，泳道3和泳道5中，可以看到目的片段2000bp 左右，载体大小约为5200bp左右。泳道3和泳道5均为正确的载体。 实施例2重组人干扰素a 2b基因的可溶性表达载体pBPE172- a 2b的构建1)通过总结和分析大量关于干扰素活性位点的数据后，利用PCR的方法，合成重组 人干扰素a2b优化序列(序列表SEQ IDN0.3所述的核裙酸序列)，起始端加入酶切位点 EcoRI，结束端加入酶切位点HindIII。重组人干扰素a2b中含有166个氨基酸，其基因序列的长度在498bp。引物的设计与合成-根据序列表SEQIDN0.3所述的核苷酸序列设计合成8对引物(A1 A8)，长度为60 80bp，相邻引物的重叠区域为12bp， Tm值在50 6(TC范围。设计上游引物ES和下游引物 HX，上游引物ES引入酶切位点EcoRI，下游引物HX引入酶切位点HindIII。各引物序列如下 'ES (直线为酶切位点)CGCGAATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人干扰素α　２ｂ基因的可溶性表达载体ｐＢＰＥ１７２－α　２ｂ的构建方法，其特征由如下步骤组成：　（１）根据大肠杆菌ＥｃｏｌＣ１９５８基因序列，设计引物扩增得到产物ＥｃｏｌＣ１９５８，用ＸｂａＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切质粒ｐＥＴ２ ８ａ和扩增产物ＥｃｏｌＣ１９５８，连接，构建出载体ｐＢＰＥ１７２，所述载体ｐＢＰＥ１７２中包含一段ｒｂｓ序列：ＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧ　ＡＡＴＡＴＡＣＡＴＴ；　（２）将序列表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３所述的重组人干扰素α　２ｂ的核苷酸 序列与所述载体ｐＢＰＥ１７２酶切后连接，得到一种重组人干扰素α　２ｂ基因的可溶性表达载体ｐＢＰＥ１７２－α　２ｂ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广荣，杜磊，祝琳琪，罗婷，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]