硫链丝菌素的生物合成基因簇制造技术

本发明专利技术是一种由链霉菌产生的具有抗革兰氏阳性菌抗生素－硫链丝菌素（Ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含２２个基因：１０个与Ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ大环生物合成相关基因，８个与侧链生物合成相关基因，还有４个基因目前功能不明。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断硫链丝菌素的合成。本发明专利技术所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗革兰氏阳性菌抗生 素硫链丝菌素(Thiostrepton)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应 用。
技术介绍
硫链丝菌素(Thiostrepton)是硫肽类抗生素家族的一个著名成员，可由链霉 菌 S/r，o附戸s /a,"", ATCC31255 、 S/re声w拜s ATCC14921 、S/r印towj;c^ / awa//era/;y ATCC12236所产生。人们首次发现硫链丝菌素是在1954 年，但是由于它结构十分复杂，直到1989年借助了X射线晶体衍射技术才最终 阐明了其分子结构。它含有两个大环结构(分别为26员 环和27员环)，4个噻唑环，l个噻唑啉， 一个四取代的哌啶和一个喹萘啶酸结 构，整个分子共有17个手性中心。前体标记实验表明其中噻唑、噻唑啉杂环 来自于半胱氨酸，哌啶环由两个丝氨酸经酶催化后形成，喹萘啶酸由色氨酸衍生 而来。硫链丝菌素具有良好的生物活性。它对革兰氏阳性菌有广谱而且强有力的 抑制作用，特别是对多种耐药性的条件致病菌具有极强的杀伤作用。硫链丝菌素 抑制革兰氏阳性菌的机制是因为它能与50S核糖体亚单元上的23S rRNA-Lll蛋 白复合物结合，抑制延长因子的GTPase活性,从而抑制蛋白质的合成。近年来还发现硫链丝菌素有抗疟疾的活性，对人类疟原虫 (P/oywo必ww々/">7^/附)的IC5o值达到了3.2nM， Jonghee 等人还在2002年报道了硫链丝菌肽的抗癌活性 但是，由于硫链丝菌素水溶性不好，生物利用度较低，大大限制了它的医药用途， 目前只作为畜用抗生素。人们希望能获得一些它的结构类似物，从中筛选出活性 更好，更有利于实际使用的分子。由于硫链丝菌素极其复杂的分子结构，即使是 在有机合成化学髙度发达的今天，通过化学全合成来获得产品也是一项艰巨的挑战。直到2004年才首次报道了硫链丝菌素A的化学合成，整个合成过程操作繁琐，产率低下。通过化学合成所 获得的结构类似物即使在活性和水溶性方面的性质得到改善，也可能因为合成的 复杂性而使实际生产成本过高。我们以微生物来源的硫链丝菌素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发， 采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成， 通过对其生物合成机制的研究揭示了其经由核糖体合成的生物合成机制，并揭示 了包括喹萘啶酸在内的独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上运用代谢工程 的原理，合理修饰硫链丝菌素的生物合成途径，探索水溶性好、生物利用度高、 活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。
技术实现思路
本专利技术涉及一种由链霉菌5^印tow;;c^ /"wew衍ATCC31255产生的具有抗革 兰氏阳性菌活性的抗生素一一硫链丝菌素(Thiostrepton)的生物合成基因簇的克 隆、测序、分析、功能研究及其应用。本专利技术中整个基因簇共包含22个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其 中一个基因(TsrH)负责编码硫链丝菌素的前体肽，九个基因(加0、加M、加丄 to《、加S、加Z、加/、加C、加及)负责对加/Z编码的前体肽进行后修饰，形成 整个大环骨架；七个基因(加F、加丄"W、 加B、 加￡>、加f/、加尸)负责以 色氨酸为前体，合成喹萘啶酸结构单元； 一个基因负责对形成的喹萘啶酸 进行活化，在其他酶的催化作用下连接到大环骨架上，并最终形成分子中的第二 个大环。本专利技术还提供了一个编码氨基转移酶的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序 列组成，命名为feM，其基因的核苷酸序列位于序列l中第3774-2686碱基处。,本专利技术还提供了一个脂肪水解酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组 成，命名为加W，其基因的核苷酸序列位于序列l中第4626-3796碱基处。本专利技术还提供了一个编码天门冬酰胺合成酶的核苷酸序列，由序列4中的氨 基酸序列组成，命名为&rC，其基因的核苷酸序列位于序列l中第6541-4685碱 基处。本专利技术还提供了一个编码酯环化酶的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列 组成，命名为"rZ)，其基因的核苷酸序列位于序列l中第7088-6681碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基-CoA脱水酶的核苷酸序列，由序列6中的氨 基酸序列组成，命名为to^，其基因的核苷酸序列位于序列1中第8449-7163碱 基处。本专利技术还提供了一个编码甲基转移酶的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序 列组成，命名为tsrF，其基因的核苷酸序列位于序列l中第9529-8594碱基处。本专利技术还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列 组成，命名为"K ，其基因的核苷酸序列位于序列l中第10241-9600碱基处。本专利技术还提供了一个编码硫链丝菌素前体肽的核苷酸序列，由序列9中的氨 基酸序列组成，命名为"rH，其基因的核苷酸序列位于序列1中第10570-10746 碱基处。本专利技术还提供了一个编码水解酶的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列 组成，命名为&r/，其基因的核苷酸序列位于序列l中第11461-12054碱基处。本专利技术还提供了一个编码脱水酶的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸序列 组成，命名为ten/，其基因的核苷酸序列位于序列l中第12047-14848碱基处。本专利技术还提供了一个编码脱水酶的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列 组成，命名为/^《，其基因的核苷酸序列位于序列l中第14845-15885碱基处。本专利技术还提供了一个编码未知蛋白(可能负责催化D-A反应)的核苷酸序 列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为"M，其基因的核苷酸序列位于序 列1中第15872-16978碱基处。本专利技术还提供了一个编码NADH依赖的氧化酶的核苷酸序列，由序列14中 的氨基酸序列组成，命名为"rM，其基因的核苷酸序列位于序列1中第 16975-18744碱基处。本专利技术还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序 列组成，命名为/^7V，其基因的核苷酸序列位于序列1中第18741-20579碱基处。本专利技术还提供了一个编码氮杂五元环环化酶的核苷酸序列，由序列16中的 氨基酸序列组成，命名为欲O，其基因的核苷酸序列位于序列1中第20576-22621 碱基处。本专利技术还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列17 中的氨基酸序列组成，命名为tof，其基因的核苷酸序列位于序列1中第 22599-24023碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基-CoA合成酶的核苷酸序列，由序列18中的氨 基酸序列组成，命名为加2，其基因的核苷酸序列位于序列l中第23999-25312碱基处o本专利技术还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列19 中的氨基酸序列组成，命名为其基因的核苷酸序列位于序列1中第 25422-26612碱基处。本专利技术还提供了一个编码脱水酶的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列 组成，命名为"nS，其基因的核苷酸序列位于序列1中第26603-29413碱基处。本专利技术还提供了一个编码硫腺苷甲硫氨酸转移酶的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为toT，其基因的核苷酸序列位于序列1中第 29430本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗革兰氏阳性菌活性的抗生素－硫链丝菌素的生物合成基因簇，其特征在于编码硫链丝菌素生物合成所涉及的２２个基因，具体为：　１）１个氨基转移酶基因，即ｔｓｒＡ：　ｔｓｒＡ位于基因簇核苷酸序列第３７７４－２６８６个碱基处，长度为１０ ８９个碱基对，氨基转移酶，３６２个氨基酸；　２）脂肪酶基因，即ｔｓｒＢ：　ｔｓｒＢ位于基因簇核苷酸序列第４６２６－３７９６个碱基处，长度为８３１个碱基对，编码脂肪酶，２７６个氨基酸；　３）天门冬酰胺合成酶基因，即：ｔｓｒＣ 　ｔｓｒＣ位于基因簇核苷酸序列第６５４１－４６８５个碱基处，长度为１８５７个碱基对，编码天门冬酰胺合成酶，６１８个氨基酸；　４）酯环化酶基因，即基因ｔｓｒＤ：　ｔｓｒＤ位于基因簇核苷酸序列第个７０８８－６６８１碱基处，长度 为４０８个碱基对，编码酯环化酶，１３５个氨基酸；　５）酰基－ＣｏＡ脱氢酶基因，即ｔｓｒＥ：　ｔｓｒＥ位于基因簇核苷酸序列第８４４９－７１６３个碱基处，长度为１２８７个碱基对，编码酰基－ＣｏＡ脱氢酶，４２８个氨基酸；　６）甲 基转移酶基因，即ｔｓｒＦ：　ｔｓｒＦ位于基因簇核苷酸序列第９５２９－８５９４个碱基处，长度为９３６个碱基对，编码甲基基转移酶，３１１个氨基酸；　７）与ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ侧链生物合成相关但具体功能未知的基因，即：ｔｓｒＧ：ｔ ｓｒＧ位于基因簇核苷酸序列第１０２４１－９６００个碱基处，长度为６４２个碱基对，编码一个未知功能蛋白，２１３个氨基酸；　８）前体肽基因，即ｔｓｒＨ：　ｔｓｒＨ位于基因簇核苷酸序列第１０５７０－１０７４６个碱基处，长度为１７７个碱 基对，编码Ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ前体肽，５８个氨基酸；　９）水解酶基因，即ｔｓｒＩ：　ｔｓｒＩ位于基因簇核苷酸序列第１１４６１－１２０５４个碱基处，长度为５９４个碱基对，编码水解酶，１９７个氨基酸；　１０）脱水酶基因，即 ｔｓｒＪ：　ｔｓｒＪ位于基因簇核苷酸序列第１２０４７－１４８４８个碱基处，长度为２８０２个碱基对，编码脱水酶，９３３个氨基酸；　１１）脱水酶基因，即ｔｓｒＫ：　ｔｓｒＫ位于基因簇核苷酸序列第１４８４５－１５８８５个碱基处， 长度为１０４１个碱基对，编码脱水酶，３４６个氨基酸；　１２）与ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ大环合成相关具体功能未知基因，即ｔｓｒＬ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，廖日晶，虞沂，段炼，雷春，丁莹，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]