抗P选择素单链抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗Ｐ选择素单链抗体及其应用。其目的是提供一种具有特异靶向性的抗Ｐ选择素基因工程单链抗体及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。抗Ｐ选择素单链抗体是下述氨基酸残基序列之一：１）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１；２）将序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并对Ｐ选择素具有特异的靶向性，具有更好地抗黏附／抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用的蛋白质。该蛋白对Ｐ选择素具有特异的靶向性，具有更好地抗黏附／抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用，可用于制备治疗机体炎症反应的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因产品领域，特别是涉及一种具有特异靶向性的抗P选择素基因工 程单链抗体及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。
技术介绍
炎症反应是多种疾病如肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病及创伤后 共同的重要的病理过程。各种炎症虽然有其特殊性，但从局部的病理变化看来,它们 都有很多共同点，即都是机体对致炎因子的损伤作用所产生的一种过激反应。最近的 研究发现，当炎症的程度严重或发展成慢性炎症时，它可能导致多种疾病的发生。炎症反应始于炎症细胞黏附、迁移、浸润、活化以及炎症因子释放，白细胞与内 皮细胞的粘附是炎症的起始步骤，这一过程是由炎症细胞和血管内皮细胞表面的细胞 粘附分子所介导。粘附分子是由细胞合成的一种复合膜蛋白，存在于细胞膜或细胞外， 在炎症过程中对白细胞和内皮细胞间相互作用起着关键的作用。粘附分子介导的粘附 过程，首先是选择素减慢血流中的白细胞，使其滚动到血管内皮表面，然后整合素和 免疫球蛋白超家族促进白细胞粘附到血管壁，并使其进入内皮。选择素家族主要介导白细胞血管壁粘附的第一阶段。即可逆性粘附阶段使白细胞 流动性减慢，形成滚动，为进一步粘附创造条件。P选择素(P-selectinectin， Ps) 又称(GMP-140)，是一种分子量为140kD的I型膜糖蛋白，主要分布于静息血小板的 a颗粒和内皮细胞的Weibel palade小体中。当受炎性介质刺激后，P选择素快速转位 到细胞表面进行表达，与中性粒细胞、单核细胞上的抗原结合，介导白细胞在内皮上 黏附、滚动、聚集及活化并释放炎症递质，参与炎症反应。P选择素作为血小板/内皮细胞活化的标志和黏附受体，介导白细胞与活化内皮细 胞等最初黏附，是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。正常情况下P选择素不 表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表达，且原先不表达的组织也出 现表达。P选择素参与了肿瘤、心血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相 关的疾病(如关节炎、早老性痴呆病、骨质疏松症等)等多种病理生理过程，其过度 或持续表达己成为某些组织病变的标志。因此，抑制P选择素表达及其细胞黏附作用 为以上疾病的诊断和治疗提供了新的策略。因此，进一步研制抗P选择素的基因工程 抗体，无疑在与炎症相关疾病的诊断和治疗中具有重要的价值。目前国内外已发现了一些具有抑制P选择素活性的物质，如于岩藻多糖、P选择 素单克隆抗体和PSGL-1的抗体。实验表明这些物质在抑制炎症反应方面具有良好的 效果，但是还存在很多问题，如应用上带来很大副作用，特异性较差等。
技术实现思路
本专利技术提供了本专利技术的目的在于提供一种能够特异靶向于P选择素位点，抑制P 选择素表达及其细胞黏附作用，从而达到抗炎治疗的作用的抗P选择素单链抗体。 本专利技术所提供的抗P选择素单链抗体，是下述氨基酸残基序列之一1) 序列表中的SEQ ID NO: 1;2) 将序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加并对P选择素具有特异的耙向性，具有更好地抗黏附/抗炎耙向抑制效应， 对机体的炎症反应具有很好的治疗作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO: 1由240个氨基酸残基组成。 编码上述抗P选择素单链抗体的基因，是下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列;2) 编码序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；3) 与序列表中SEQ ID NO: 2限定的核苷酸序列具有90X以上同源性且对P选择 素具有特异的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具 有很好的治疗作用的核苷酸序列；4) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。所述高严谨条件为杂交后用含0. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液在 65X:下洗膜。序列表中的SEQ IDNO: 2由720个碱基组成，其编码序列为自5，端第1-720位 碱基，编码具有序列表中SEQ IDNO: 1的氨基酸残基序列的蛋白质。具体来讲，所述抗P选择素单链抗体的重链可变区PVh具有序列表中的SEQ ID NO: 3的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID NO: 3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基 酸残基的取代、缺失或添加且对P选择素具有特异的靶向性，具有更好地抗黏附/抗 炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用的多肽；轻链可变区PVL具 有序列表中的SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID NO: 4的氨基酸 残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对P选择素具有特异的靶向 性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用 的多肽。序列表中的SEQ ID NO: 3由122个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID NO: 4 由108个氨基酸残基组成。编码抗P选择素单链抗体的基因，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO: 5的DNA序列或编码序列表中SEQ ID NO: 3的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表 中SEQ ID NO: 5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；轻链可变区编码基因具有序列 表中SEQ ID NO: 6的DNA序列或编码序列表中SEQ ID NO: 4的DNA序列或在高严谨 条件下可与序列表中SEQ ID NO: 6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在O. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液中，65°。条 件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO: 5由366个碱基组成，其编码序列为自5'端第1至366 位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 3的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的 SEQ ID NO: 6由324个碱基组成，其编码序列为自5，端第1至324位碱基，编码具 有序列表中SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本专利技术抗P选择素单链抗体编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均 属于本专利技术的保护范围。扩增抗P选择素单链抗体编码基因中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还提供了用于表达上述抗P选择素单链抗体的重组表达载体。本专利技术所提供的用于表达上述抗P选择素单链抗体的重组表达载体，是含有抗P 选择素单链抗体基因的重组表达载体。所述抗P选择素单链抗体基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体 的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、 酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒或其它载体)。 总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一 个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。所述原核表达载体可为pET-32a、 pET-28a、 pET-28b、 pET-28c、 pET-21a(+)或 pET-30a等；所述真核表达载体可为pEE14. 1、pCMV5、pSilence1. 0-U6(Ambion， Austin, TX， USA) 、 pc醒、pEGFP-Nl、 pSV40、 p本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗Ｐ选择素单链抗体，是下述氨基酸残基序列之一：　１）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１；　２）将序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并对Ｐ选择素具有特异的靶向性，具有更好地 抗黏附／抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宏彬，张传福，贾雷立，周育森，徐元勇，王勇，刘雪林，靳连群，孙岩松，黄留玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]