一种抗肿瘤融合蛋白及其应用制造技术

提供一种新型的抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤融合蛋白包括至少一个生物活性分子和卷曲螺旋结构域，所述生物活性分子源自ＴＮＦＳＦ１０或其改构体，所述卷曲螺旋结构域源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自根据能天然形成多聚体蛋白质的卷曲结构域进行人工合成的多肽。本发明专利技术新型融合蛋白中的卷曲螺旋结构域能天然形成稳定的３α螺旋，从而促进融合蛋白形成稳定的三聚体结构，相比于天然ＴＮＦＳＦ１０，稳定性好、利于保存，在体外对多种人体肿瘤细胞具有更显著的凋亡诱导作用，其抗肿瘤活性有明显提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。(二)
技术介绍
肿瘤坏死因子超家族(TNF superfamily, FNFSF )成员众多，空间结构相似，有不同程度的同源性。配体为n型跨膜蛋白，能以膜结合或可溶性形式发挥作用；受体为I型或III型膜蛋白，受体与配体结合，启动下游 信号转导，诱导细胞生长、分化和凋亡，在组织自稳、炎症的免疫调节中 发挥重要作用。TNFSF10最初是利用与FasL、 TNF的同源性从人的表达序列标签 (EST)文库中发现的。与TNF超家族中的其它成员一样，TNFSF10属 典型的II型5争膜蛋白，由281个氨基酸组成，分子量为32KDa。 N端第 15-40位氨基酸残基为疏水区，形成^争膜结构；C端(胞外区)可4皮金属 蛋白酶从细胞膜上切下，得到具有生物学活性的可溶性分子。重组人可溶 性TNFSF10蛋白在体外能诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括肺癌细胞、乳腺 癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞以及结肠癌细胞等，而对大多数正常组 织细胞则无诱导凋亡作用。研究资料表明，TNFSF10有五种受体，包括DR4(death receptor 4 or TNFSF10-R1) 、 DR5(TNFSF10-R2) 、 DCR1(TNFSF10-R3)、 DCR2(TNFSF10-R4)以及OPG(osteoprotegerin)。 DR4和DR5属于TNFR 超家族成员中的死亡受体，细胞内区域含有高度保守的与TNFR、 Fas同 源的死亡结构域(DD, death domain),可诱导细胞凋亡；DCR1和DCR23尽管细胞外区域和死亡受体高度同源，但是细胞内区域要么结构域不完整(DCR2)，要么根本就没有(DCR1),因此，二者均不能传导凋亡信号， 被称为诱骗受体；OPG则是一种特殊受体，以分泌糖蛋白形式存在；后 三种受体可通过竟争性抑制TNFSF10与死亡受体的结合来调控其诱导的 细胞凋亡。为进一步研究TNFSF10蛋白的作用机理以及在抗肺瘤药物方面的应 用潜力，研究人员利用基因工程重組技术，构建了多种可溶性TNFSF10 蛋白，包括含胞外区95 281位氨基酸残基的TNFSF1095-2引蛋白(SEQLD NO: 2)、含胞外区114 281位氨基酸残基的TNFSF10114-281蛋白(SEQID NO: 3)以及融合有标签蛋白(如His、 FLAG)的TNFSF10融合蛋白。 动物实验表明，重组人可溶性TNFSF10蛋白对多种移植到小鼠体内的月中 瘤模型有显著疗效,且对鼠科及非人灵长类动物的正常组织器官无明显毒 副作用，显示出其在抗肿瘤药物领域具有巨大的应用前景。目前，重组人 可溶性TNFSF10114_281蛋白在国内外均已进入临床研究阶段。晶体结构显示，可溶性TNFSF10蛋白呈同源三聚体结构， 一个Zn" 隐藏在三聚体的中心，与三个Cys230残基及一个氯原子配对，Zn"的存 在对维持人可溶性TNFSF10蛋白的结构和功能具有重要作用。另有研究 资料表明，天然重组人可溶性TNFSF10蛋白在溶液中有多种存在形式， 主要包括三聚体、二聚体以及单体，其中最主要的及活性最高的形式是同 源三聚体。然而，研究表明相当一部分可溶性TNF超家族蛋白，在溶液 中仅仅由细胞外区域构成的同源三聚体是不稳定的。例如，人们在比较 TNFa和LT功能时就曾发现天然可溶性的TNFa三聚体在生理条件下是 不稳定的；又如，人们在试图将CD40L开发成治疗药物的研究过程中发 现，CD40L可溶性三聚体活性较低的重要原因之一是其在溶液中的稳定性较差。实验发现TNFSF10蛋白也存在同样的稳定性不理想的问题，这 不仅影响其保存，且可能与其在动物体内的半衰期短等问题有关。为了提高具有医疗价值蛋白质的生物学活性，包括提高单位活性、热 力学稳定性、血液半衰期、保质期。人们常常对天然蛋白进行修饰。目前 有多种途径可以改善药用蛋白的生物活性，一种方法是通过化学结合诸如 PEG这样的试剂来提高蛋白分子量，从而提高生物学活性的方法。该法 也叫PEG化，起初是为了降低免疫原性。据报道，已有多种蛋白药物进 行PEG化。另一种方法是将目标蛋白和人血清白蛋白(HA)融合，形成 一特殊氨基酸序列。专利WO01/79840就是用这种方法来提高hGH蛋白 稳定性和半衰期，据报道其生物学活性提高是由hGH-HA融合蛋白稳定 性增加造成的。
技术实现思路
本专利技术目的是提高TNFSF10蛋白稳定性和抗肿瘤活性，提供一种新 型的抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 本专利技术采用的技术方案是一种抗肺瘤融合蛋白，包括至少一个生物活性分子和巻曲螺旋结构 域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改构体，所述巻曲螺旋结构域 源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自才艮据能天然形成多聚体蛋白质 的巻曲结构域进行人工合成的多肽。所述生物活性分子源自TNFSF10,是指所述生物活性分子可为 TNFSF10的全部或部分氨基酸序列的片段(尤其是胞外多肽片段，优选 为95~281或114~281位的多肽片段)，所述"改构体"指相对于原始 TNFSF10的全部或部分多肽序列，仅涉及单个或多个氨基酸的点突变， 突变后多肽的功能发生了变化，但主要的序列和结构未发生明显改变。这里的TNFSF10蛋白是按照TNF超家族(TNFSF )统一命名法则得 来的，其序列如SEQIDNO: 1所示。所述巻曲螺旋结构域，是一种能与其它类似或相同的巻曲螺旋相互作 用的肽、多肽。这里的相互作用是指能形成多肽或蛋白质多聚体的类型， 这种相互作用是由多聚体结构域之间的共价健、氢键、疏水作用、范得华 力以及盐桥等作用力共同作用形成的。巻曲螺旋(coiled coil)是存在于 多种天然蛋白质中的结构模式，巻曲螺旋的 一个共同特点是在它们的 一级 结构中含有多个重复的由7个氨基酸组成的"七肽单元"(abcdefg)。每个单 元中的a、 d位多为非极性疏水氨基酸残基，如亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(lie)、缬氨酸(Val)等，这些位置的氨基酸残基特异性地位于巻曲螺 旋结构的内侧；e、 g位多为极性带电氨基酸，如赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)等，这些氨基酸残基位于a、 d位氨基酸残基相互作用所形成的疏 水核心的外侧。巻曲螺旋结构域能天然形成稳定的二聚体、三聚体、多聚 体。本专利技术人发现，将至少一个TNFSF10多肽分子和巻曲螺旋结构域融 合而构成的抗肿瘤融合蛋白，其生物学活性有明显提高。因此本专利技术为肿 瘤治疗提供另 一种潜在的可供选择的新型抗肿瘤融合蛋白。所述"生物活性提高"包括根据本专利技术生产的融合蛋白比天然 TNFSF10蛋白具有更高的抗胂瘤活性。所述"生物活性提高"也包括比天然TNFSF10蛋白具有更高的热力 学稳定性、制备过程抗理化因素影响能力较强、具有更长的保质期等。所述"生物活性提高"还包括几种功能的结合，例如，新型抗肿瘤融 合蛋白抗肺瘤活性提高的同时，稳定性也有明显提高。可以预料，本专利技术 提供的融合蛋白与天然TNFSF10蛋白相比，血液半衰期也将会延长、有 效用药量将会减少。优选的，所述生物活性分子为具有下列氨基酸序列的多肽之一① SEQIDNO: 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤融合蛋白，包括至少一个生物活性分子和卷曲螺旋结构域，所述生物活性分子源自ＴＮＦＳＦ１０或其改构体，所述卷曲螺旋结构域源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自根据能天然形成多聚体蛋白质的卷曲结构域进行人工合成的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪昌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]