一种细菌五型分泌蛋白及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学、基因工程及免疫学领域，具体的说是一种细菌五型分泌蛋白、其自我运输和表面展示功能在疫苗抗原表达及传递中的应用。具体为所述五型分泌蛋白具有序列表ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１中的碱基序列，其应用方法：以荧光假单胞菌ＴＳＳ１为模板，通过ＰＣＲ获得五型分泌蛋白基因，用其构建质粒ｐＡＴ２；以迟缓爱德华氏菌ＴＸ１为模板，通过ＰＣＲ获得抗原蛋白基因，与质粒ｐＡＴ２连接而得表面展示型质粒ｐＡＴ１８，后者转化入大肠杆菌，即得细菌表面展示型保护性疫苗，可以直接接种免疫。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、基因工程及免疫学领域，具体的说是一种荧 光假单胞菌五型分泌蛋白及其构建方法和应用。
技术介绍
原核生物分泌蛋白可以依据其在细胞中的转运特征而划分为几大类。其 中，五型分泌蛋白具有十分独特的性质。不同于其它分泌蛋白，五型分泌 蛋白自身具有完全的转运功能，不依赖于细胞的任何其它蛋白质转运系统， 因而这类分泌蛋白亦称为自我运输蛋白。在功能结构上，五型分泌蛋白通常具有一个位于N端的分泌信号肽， 一个位于前端的被运输的"乘客"蛋 白域，以及一个C端的转运功能域。N端信号肽指导蛋白质进入胞间质，随 后转运功能域在细胞膜上形成一个运输通道，被运输的"乘客"蛋白通过 此通道而被输送至胞外。由于这类蛋白的各功能域结构相对独立，因而这 些功能域可以被不同的异源蛋白代替，例如被运输的"乘客"蛋白可以被 某些合适的异源蛋白取代，这种取代不影响N端信号肽和C端转运功能域 的作用
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种荧光假单胞菌五型分泌蛋白及其构建方法 和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为 细菌五型分泌蛋白由序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列组成。 细菌五型分泌蛋白的构建方法l)质粒pATl构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物AF11和AR9 进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5oc,得质 粒pBSAl;将用Seal酶切的质粒pBR322与寡聚核苷酸L11连接，连接液转 化大肠杆菌DH5a,得质粒p329;将用EcoRV酶切的质粒p329与用Swal/Smal 酶切的质粒pBSAl连接，连接液转化大肠杆菌DH5a,得质粒pATl;所述寡聚核苦酸L11序歹'J为5， - AAATCCCGGTCTAGAATTT - 3，；2 )质粒pAT2的构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物AF12和AR12 进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5cx,得质 粒pBSA2，将用Seal酶切的质粒pBSA2回收的2kb片段与用EcoRV酶切的 质粒pATl回收的5. lkb片段连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a,得质粒 pAT2;3)质粒pAT18的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ETF6和ETR1进行PCR扩增，产物与Seal酶切的质粒pAT2连接，连接液转化大 肠杆菌DH5oc,得质粒pAT18具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的细菌 五型分泌蛋白。所述步骤l)中用Scal酶切质粒pBR322,回收13kb片段，而后将其 与寡聚核苷酸Lll用T4DNA连接酶于室温连接2 - 4小时，连接液转化入大 肠杆菌DH5a。所述步骤l)中用EcoRV酶切质粒p329,回收4Mkb片段； 将其与用Swal/Smal酶切质粒pBSAl的回收M0bp片段连接，用T4駆连 接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a。所述步骤3 ) 中PCR产物与Seal酶切质粒pAT2回收的7. lkb片段于室温连接2 - 4小时， 连接混合液转化大肠杆菌DH5 a 。所述转化入大肠杆菌DH5 a后均在含有100 ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24 ug/ml异丙基-P-D-硫代半乳糖 苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选白色转化子质粒。将所述具有 序列表SEQ IDNo. 1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白在含有100ug/ml的 Ap的LB液体培养基中过夜培养，取lml过夜后的培养液将其加入100ml 新鲜的LB液体培养基中，于37。C下摇动培养至OD鋼为0.8,而后离心，收 集菌液，即得表达具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的细菌五型分泌 蛋白的疫苗抗原，其具有免疫功能。所述以160-200rpm摇动培养，离心条 件为5000g, 4。C， 10min。本专利技术具有如下优点1. 应用性广。本专利技术的五型分泌蛋白具自我运输功能，不依赖于宿主 细胞的蛋白质转运系统，可以将其所携带的异源抗原蛋白成功运至胞外并 展示于细菌表面。因而可以在多种革兰氏阴性菌中自我分泌。另外，本发 明的五型分泌蛋白对于异源蛋白的结构和大小要求低，能够容忍大型异源 蛋白的插入，故可用作不同类型异源蛋白的运输载体。2. 高保护率。本专利技术的Pfa表面展示疫苗对迟缓爱德华氏菌的免疫保 护效率达80%。3. 省时省力、简单易行。本专利技术的疫苗抗原制备过程简单，无需蛋白 质提取、纯化等。附图说明图1为疫苗抗原细菌表面展示图(其中图1: Western immunoblot实 验检测含有pAT18的DH5oc是否能将疫苗展示到细胞外膜。泳道l:分子量 marker;泳道2、 3、 4分别为细胞外膜蛋白、细胞内蛋白、胞间质蛋白)。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例 描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均釆用如下方法 l.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组 DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相应试剂盒。2. 质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 );3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"， 北京。4. 所有抗生素的使用浓度如下安卡青霉素Up), 100叫/ml;卡那霉 素(Kn), 50ug/ml;氯霉素(Cm), 30ug/ml;四环素(Tc), 15ug/ml。实施例1本专利技术的五型分泌蛋白由序列表SEQ ID No. 1中的pfal碱基序列组成。 本专利技术五型分泌蛋白构建方法1) 质粒pATl的构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用下列引物PCR: AF11 (5， - CGCGGCGTTAACATTTAAATTGATGACGCACATATCCA -3， )， AR9 (5， - CCCGGGATATCAGTACTATTGACCTGAGCTTCC -3， ), PCR条件为:94。C 60s预 变性模板DM，然后94t40s， 51°C60s, 72°C 60s， 5个循环后改为94°C 40s， 66°C 60s， 72°C 60s， 25个循环后再在72"C延伸反应10min。 PCR产物用天 根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于"天根生化科 技有限公司"，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 oc后在含有100 ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml Xga 1 (5-溴-4--氯-3--乳糖普)和24 ug/ml异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB 固体培养基上培养24 - 30小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为pBSAl。 将质粒pBR322 (购于"纽英伦生物技术有限公司"，北京)用Seal酶切， 回收4. 3kb片段，将其与寡聚核苷酸Lll,其中寡聚核苷酸Lll为5'-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌五型分泌蛋白，其特征在于：具有序列表ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１中的碱基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，胡永华，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]