在微生物发酵过程中清除消泡剂的方法技术

在培养微生物产生酶时通常都使用消泡剂．这些消泡剂常常是在酶的制作过程中残留下来．从而减慢了过滤，堵塞过滤膜，对最终产物的质量造成不利影响．本发明专利技术介绍一种用矿物粘土优先采用浆土去除酶系统中消泡剂以及糖类和色素的方法．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
由于起泡在用微生物生产酶时是一个经常遇到的问题，可以常常使用消泡剂。这些消泡剂以及一些像醣类和色素之类的其它讨厌的组份在酶的制作过程中残留下来，并且堵塞超滤膜。本专利技术企图通过向含酶全发酵肉汤或酶液加入矿物粘土而清除消泡剂，同时也除去醣类及色素。泡沫在本例指的是发泡的液体，它是在一个连续液相里分布有空气或其它气体的一个不连续液相果分布有空气或其它气体的一个连续相。通常由于空气或气体组成较大的泡沫体积，所以泡沫里的泡只被一层薄的液体分隔。这些不想要的泡沫是由机械或化学作用造成的无数小泡组成的，它们是在液体里面产生，而且在液体表面积累此之消散要快些。在培养微生物产酶时;泡沫的形成可能是个很难解决的问题。如果不适当控制，泡沫会降低设备的生产能力延长加工时间及增加成本。还可引起像降低生物催化活性等的其它困难。由于这些原因，使用抗泡沫剂是必需的，如果它们在加工的最后步骤或在最终产物里出现时，常常是否理想的甚至是有害的。用作制备消泡剂的方法极多，参看以下实例Colbenl，J.C.在美国Noyes数据公司发表了“泡沫、乳剂控制剂及控制方法”J.B.Plumb在已转让给英国帝国化工公司的美国专利号3，865，859(1975.2.11)里面介绍，硅氧烷基的聚合物是用有机氯硅烷或烷氧硅烷与烷烯或氧化烯二醇相作用而制得的。这些聚合物以及许多其它的硅烷基的聚合物是很有用的表面活性剂，特别是用来抑制含水系统里的泡沫形成更是如此。本专利技术特别与酶的工业生产上广泛使用消泡剂控制泡沫形成有关。因为酶起着生物催化剂的作用调节许多在生物有机体里自然出现的化学反应过程，一旦分离出，像在制革工业，洗涤剂工业及食品工业中用途。典型的工业生产包括在含无机盐、碳源、氮源及消泡剂的适宜培养基里培养产酶的微生物。在分离菌体(biomass)之后，消泡剂归到含酶溶液里，并形成一粘性层。因为它结在超滤膜之表面，从而大大地减慢了过滤速度。众所周知，当消泡剂较热时一般趋向形成沉淀。因此，惯常的酶的加工往往是在超滤之前用加热这一步来消除消泡剂。例如，把整个酶溶液的温度用几分钟时间升至60℃，或将酶溶液通过热的蛇形管而获得相似的作用。加热之后过滤清除消泡剂。这一方法从耗能来看不仅经济且对受热易变的酶来说也是不可行的。直至最后阶段在热处理可行或热处理可实施的加工条件里，当被加热的体积已大大地减小时，就把酶溶液保持冷却以利抗泡剂残渣呈溶液状和通过滤膜。然而在经常，在这一步使用的中空纤维膜系统上出现的大量摩擦，往往产生足以造成抗泡剂沉淀的热量，且甚至堵塞滤膜。本专利技术的目的是从含酶系统里清除消泡剂。尤其是本专利技术提出了一个包括向酶的全肉汤或其溶液加入一种像浆土之类的矿物粘土来除去消泡剂还经常用于除去醣类和/或色素的一个简单而经济的方法。本专利技术提供了一个的在合适的有营养的生长培养基里培养产酶的微生物来供应一种含有这种酶的发酵肉汤当中加入一种聚阳离子消泡剂而生产酶的一种改进方法。这种改进包括a)在控制不会导致粘土和酶形成反应产物的PH条件下把矿物粘土加到发酵肉汤里与消泡剂形成复合物，以便形成固体粘土/消泡剂复合物而把酶留在溶液里;和b)利用固体/液体分离技术把粘土/消泡剂复合物从发酵肉汤里分离出来。与在合适的有营养的生长培养基里培养产酶的微生物来供应含有这种酶的发酵肉汤当中加入聚阳离子消泡剂而生产酶的方法相结合方面，本专利技术还提出了改进措施，其中包括a)在控制会导致粘土和酶形成反应产物的PH条件下，把矿物粘土加到发酵内汤里与消泡剂形成复合物，以便形成固体的粘土/消泡剂复合物和/固相酶/粘土反应产物;b)将PH调节到超出酶和粘土形成反应产物的范围，借以使酶返回溶液里;和c)利用固体/液体分离技术，将粘土/消泡剂复合物从发酵内汤里农离出来，这个方法亦可与从全发酵肉汤除了菌体之后的无细胞滤液或上清液使用之。本专利技术对胞内酶和胞外酶或它们的混合物都很好地起作用。因此，这种酶可能是在发酵过程里分泌的胞外型酶，或者也可能是从众所周知的方法溶解而得的一种胞内酶型，例如，利用声处理惑加入一种洗涤剂破碎细胞而使酴酶从细胞里释出。在适宜的条件下，有些微生物两类酶都产生。粘土可以直接地加进全发酵肉汤内。所谓发酵肉汤，意味着从酶的生产过程中的酶(类)，菌体及残留的发酵养份等所有产物都在发酵之后立即出现。粘土加入之后，它就和从生产酶的过程中留下的消泡剂形成复合物而把酶留在溶液里。这种复合物凝结并沉在反应罐的底部。因此，从肉汤分离出菌体时，这种粘土消泡剂复合物亦会被清除。在加进粘土之后，像过滤和离心之后轻轻倾倒出上清液等任何固体/液体分离技术都能用来把复合物从发酵肉汤中分离出来。本专利技术还企图在加进颗粒粘土之前从含酶的方向肉汤里分离菌体。像过滤和离心等任何固体/液体分离技术都可以用来清除菌体，并靠它提供一种无细胞的含酶溶液。因此，这种粘土可加在含酶溶液里(即这种培养滤液或上清液)形成粘土/消泡剂复合物，它们可以任何固体/液体分离技术从这种液体分离而出。在另一个具体实施例里，这些菌体可重行淤浆化，例如，变成水溶液状，这种淤浆离心或过滤而分离出菌体。随后又加进另一些粘土到这种第二次的上清液或滤液里，这样就会通过“冲洗”在菌体的细胞收集残余的酶而增加酶的最终产量。正如在用全发酵肉汤进行这个过程时一样，它会形成粘土/残留消泡剂复合物。这种复合物凝结并用像过滤和离心方法分离出来。因此就发现额外的酶。从包括加粘土进全发酵肉汤在内的那些具体实施例里注意到有10%以上的消泡剂能够和菌体一起被分离出来。另一方面，当发酵肉汤用像过滤和离心进行首次处理以除去或分离出菌体时，大体上所有的消泡剂，即90%或更多都能被分离出来。因此，最好在加入粘土之前优先把发酵肉汤处理以提供一种无细胞的含酶溶液。酶发酵常含醣类物质如蔗糖或淀粉(在酶的加工中它们增加发酵肉汤的粘度及色素(把不理想的颜色带到最终产物)。这些东西亦常有可能与粘土一起形成复合物，因此亦能与消泡剂一起利用固体/液体分离和除去，例如，在培养地衣芽孢杆菌菌株之后除去醣类而产生碱性蛋白酶将在后面实施例Ⅰ阐明。必须注意粘土/消泡剂复合物的形成并不由PH决定。如果本专利技术使用的是固定在粘土上不动的一类酶，那么，在一个实施例里，可以在不会导致粘土和酶形成反应产物的PH条件下加进粘土，例如，在适当的PH之下，粘土会通过在它们之间形成一种不溶性反应产物而使某些酶固定。这种的酶是转葡糖苷酶，PH3-5时它在粘土的固定作用美国专利号3，042，584揭示。美国专利号3，899，395/亦揭示了在PH4-6时浆土与脂酶会形一种不溶反应产物。因此粘土可在它与这种酶不形成反应产物的PH条件下加入。与一类在粘土上固定的酶有关的另一个实施例里，粘土可在会导致形成酶/粘土的一种不溶反应产物的PH条件下加入。它会和这种粘土/消泡剂复合物一起沉在反应罐底部，随后能够把这个PH调至这种酶和粘土会形成一种反应产物的范围之外，这将会引起酶离开粘土而重返溶液里。这种固体的粘土/消泡剂复合物随后能用如前述的固体/液体分离技术分离出来。当然，如果这酶类)是一类与粘土不大形成或不形成反应产物的酶，那么只要所选择的PH不致将这酶(类)的活性变成不理想的，粘土就可在任何PH下加入。这个PH值完全可以由熟悉这个
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【技术保护点】
一种与通过在一个适宜的有营养的生长培养液里培养一种产酶的微生物来提供一种含有该酶的发酵肉汤，在发酵肉汤中加入一种聚阳离子消泡剂而生产酶的方法相结合的方法，其中改进包括：ａ）在不会导致粘土和酶形成反应产物的ＰＨ条件下把矿物粘土加到发酵肉汤 里与消泡剂形成复合物，以形成固体的粘土／消泡剂复合物而把酶留在溶液里；ｂ）用固体／液体分离技术，把粘土／消泡剂复合物从发酵肉汤分离出来。

【技术特征摘要】
US 1985-9-24 779,504之意。实施例Ⅰ按上述从地衣芽孢杆菌制得的一种碱性蛋白酶的发酵肉汤，经过过滤除去了菌体，因而提供出无细胞的培养滤液。用液体的10%(重量/体积)的氢氧化钾将取自这种培养滤液的每个200毫升的各个等分试样分别将PH调至7.7，8.5，9.0及9.5。将一个等分试样(PH为7.7)作为对照，而把Volclag 浆土逐小块地边搅拌边加入到其它等分试样里，使其最终浓度成为2%重量/体积，这些悬浮液在5℃下搅拌45分钟。这种低温确保消泡剂不会由于自身而沉淀，相反却留在溶液里与粘土接触形成一种粘土-消泡剂复合物。这种絮凝了的复合物通过滤分离出来。这种组合滤液曾进行过消泡剂含量、总醣及酶的活性的分析。其结果证明浆土在从培养滤液里去除消泡剂及糖类是有效的，只是略为降低酶的活性而已，表Ⅰ给出这些结果。测定活性是用Miles实验学报，生物技术定量分析方法，No.400.23所介绍的方法进行的。它是以由荷兰德尔弗特荷兰皇家发酵工业有限公司发展的德尔弗特分析法为基础的。所用单位为活性以每毫升碱性蛋白酶单位，醣类以每毫升毫克，而消泡剂是以百分之一来表示。表Ⅰ样品 PH 消泡剂 醣类 酶活性(浆土%重量/体积) (百万分率) (毫克/毫升) (APU/毫升)1.AP+0% 7.7 1000 25 84402.AP+2% 7.7 30 15 77002.AP+2% 8.5 36 77004.AP+2% 9.0 40 - 77003.AP+2% 9.5 53 - 7700实施例Ⅱ重复实施例Ⅰ的步骤以获得碱性蛋白酶培养滤液，只是加进该培养滤液以除消泡剂的浆土的最佳水平改由用0.5%-3%重量/体积Vol-clay在PH7.5时与200ml的等分试样混和来测定。结果见表Ⅱ。表Ⅱ浆土浓度在25℃PH7.5时对从地衣芽孢杆菌衍生而来的碱性蛋白酶培养滤液里除去消泡剂的影响。浆土浓度 %(克/100毫升) 残留消泡剂对照组，0 1000.5 261.0 231.5 82.0 42.5 33.0 3表Ⅱ阐述了浆土除去消泡剂逐步增高的水平。因为浆土在1.5%重量/体积水平时，保留在培养滤液里的抗泡剂水平被减至不足10%，而在加入3%重量/体积的浆土之后，留下的消泡剂只是3%，所以最佳的水平看来是在1.5-3%重量/体积浆土处。实施例Ⅲ如上所述，由地衣芽孢杆菌生产的含有α淀粉酶的全发酵肉汤首先滤去菌体并为本实施例提供了无细胞的培养滤液。两种全肉汤亦都进行了试验，从耐温的α淀粉酶发酵培养滤液而来的每个100毫升的等分试样是按实施例Ⅰ相同的做法加入Volclay浆土至浓度2%和3%重量/体积以测定它们对消泡剂和醣类的作用。而在全肉汤中的所有样品中的一个则加入3%重量/体积的Volclay浆土。全肉汤的和培养滤液(CF)的对照样品(无浆土的)亦在CH7.5下作了试验。消泡剂和醣类的含量是按实施例Ⅰ一样的方法测量的。所有样品亦用比色计测试过存在的色素。总蛋自是用前面介绍过的生物放射法检测并以毫克/毫升表示。其结果归纳成表Ⅲ。处理 消泡剂 醣类总蛋白 颜色(毫克PPGS) (毫克/毫升) (毫克/毫升) (400毫微米1.全肉汤对照组 32.500 5.6 10.4 0.4212.加3%浆土的全肉汤 28.200 7.8 11.0 0.3003.CF对照组 11.500 7.5 11.0 0.2904.加2%浆土的CF 3，500 7.8 11.0 0.2705.加3%浆土的CF 750 7.5 9.8 0.250浆土去除α淀粉酶培养滤液中的消泡剂如同去除碱性蛋白酶培养滤液一样是十分有效的，浆土还有效地去除其它不想有的着色剂。然而，浆土在去除α淀粉酶培养滤液中的残留醣上如同实施例Ⅰ与那样碱性蛋白酶培养滤液去除残留醣相比，似乎是无效的，就全肉汤而言，浆土去除了13%以上的消泡剂和一些色素，但在去除醣类方面似乎是无效的。实施例Ⅳ如上所述，生产α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌的发酵是为本实施例提供全肉汤。含有液体的α-淀粉是通过离心后轻轻倾出上清液来代替过滤把它们从菌体中分离出来的。如实施例Ⅲ所用的同样步骤再度研究了以加入2%重量/体积Volclay浆土到上清液去除消泡剂的情况。发现有2%的消泡剂是在上清液里，因此，在全肉汤离心后80%的消泡剂已和菌体在一起。其后，这些菌体重行悬浮在和这肉汤原来一样体积的水里，然后离心并接着轻轻地倾出上清液提取残留的酶。用同样的做法，以2%重量/体积Volclay浆土处理这种二道的上清液，发现大部分的残留消泡剂亦被从菌体分离而进入这种第二次倾出的上清液里。浆土处理的第一次上清液去除了90%以上的保存消泡剂使得酶液里只有15ppm的PPGS。浆土处理的第二次上清液去除了大部分残留的消泡剂导致酶液只有25ppm的PPGS。实施例Ⅴ测试了像前面介绍那样制得的并含有高水平α-淀粉酶和有效水平的β-葡聚糖酶，半纤维素酶及纤维酶活性的用解淀粉芽杆前Bacillus amyloliguefaciens生产细菌性中性蛋白酶的全发酵肉汤。用过滤分离菌体以后，初级滤液的50毫升等分试样在PH6.2情况下用不同水平的Volclay浆土处理，而且还在不同的PH之下用0.5%重量/体积浆土处理。PH是用10%重量/体积氢氧化钾水溶液调整的。浆土是按实施例Ⅰ那样加进的。去除消泡剂的效应亦像实施例Ⅰ那样用同样的方法测量的。具有PH6.2所有样品亦用此色计进行过试验。其结果列于表Ⅴ。由于中性蛋白酶处在酸性PH6.2处，浆土最有效是在浆土浓度至少是1.5%时(等分样品号5.6和7)。然而当浆土在0.5%重量/体积浆土的低水平时，碱性PH下将会明显地改善消泡剂的去除(等分样品号8-12)。表Ⅴ序号 浆土水平 PH 消泡剂PPGS %(去除 颜色(毫微米)(百万分率) 消泡剂)1 0% 6.2 51，000 0 0.475(×10)2 0.1% 6.2 48，000 5.9 0.447(×10)3 0.5% 6.2 35，200 31.0 0.436(×10)4 1.0% 6.2 30，000 41.2 0.436(×10)5 1.5% 6.2 5，500 89.2 0.370(×10)6 2.0% 6.2 2，100 95.9 0.368(×10)7 3.0% 6.2 1，200 97.7 0.339(×10)8 0.5% ...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯蒂斯杰里蒙哥马利，奇曼拜珀索塔姆达斯佩特尔，
申请(专利权)人：迈尔斯实验室公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]