【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及新的通用的核酸内切限制酶类以及生产这种内切酶类的方法。更具体地说，藉着一种寡脱氧核苷酸接合体与一种已知的核酸内切限制酶结合，本专利技术涉及到的核酸内切限制酶使人们在实际上可裂解任何预定的DNA序列。核酸内切限制酶是一类在细菌体内自然产生的酶类。当将它们从其它的干扰的细胞组分中提纯出来后，就可在实验室中用来将DNA分子切割成精确的片段，此种性质能使DNA分子成为异常等同的及精确地分离成其组分亚单位。已经证明，核酸内切限制酶类是当今遗传研究中不可缺少的工具。它们是生物化学的“剪刀”，可应用来进行遗传工程及分析。核酸内切限制酶可分为三类。在相同的蛋白质部份中，类-Ⅰ及类-Ⅲ酶承担饰变(甲基化作用)及一种ATP-需要的限制性(裂解)活性。两种类型的酶都可识别在基质DNA中未甲基化的识别序列，但是类-Ⅰ酶类的裂解基本上是不规则的，而类-Ⅲ酶类则在特定的位点上切割DNA，通常是在距它们的识别位点上的一个恒定的距离来切割。类-Ⅲ限制/修饰系统包括一种分隔的核酸内切限制酶及修饰甲基酶。这些酶在DNA上接近特殊的识别序列处或在序列内切割DNA，典型的识别序列其长度为4至6个核苷酸单位，通常是两个弯折对称轴的距离。存在着多于500个的可在DNA上特定的位点裂解DNA的类-Ⅱ核酸内切限制酶。不同的识别位点的数目大于100(不算各种修饰作用，包括甲基化作用)(参阅Roberts，核酸研究，13∶r165，1985;Kessler等人，基因，33∶1-102，1985)。虽然存在的裂解位点的所有数目其数值很大，但仍常常需要增加切割位点，使之有可能进行精确的基因工程及调整...
【技术保护点】
一种能在靶ＤＮＡ的一个预定的位点上裂解该ＤＮＡ的通用的核酸内切限制酶，它包括：（ａ）一种寡脱氧核糖核苷酸接合体；及（ｂ）一种适当的限制性酶。
【技术特征摘要】
US 1986-2-5 826,220书中所指出的之外，不应被认为限制了本发明。实施例Ⅰ本例叙述了为选择靶DNA、靶序列、限制性酶而设计的方法，以及监察裂解过程的方法。(a)靶DNA的选择为了达到本实施例的目的，选择了一种噬菌体M13衍生物作为SS DNA的来源，因为(ⅰ)已经知道它的全部核苷酸排列顺序(Van Vezenbeek等人，基因11∶129-148 1980;Yanish-Perron等人，基因33∶103-119 1985)，(ⅱ)M13mp噬菌体是方便的无性繁殖载体，以及(ⅲ)ds复制的形式(RF)及SS DNA两者都易于繁殖。在M13衍生物中，选择M13mp7载体噬菌体，因为它的SS DNA含有一个小的发夹结构，该结构被设计成可用酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、AccⅠ及SalⅠ〔Messing，酶学的方法(Method in Enzymol)101∶20-78，1983〕来分解的。如在图3中所描绘的，应用FokⅠ-接合体复合物，这些切口提供了参考点以便为SS切口绘制确定的图。在图3中的粗线代表SS DNA。发夹“a”的序列如下 在位置Ⅰ上的两个切口(图3)与在图2中所叙述的相同。已经发现，在位置Ⅱ上切口的地点是被安置在近核苷酸6938处。整个M13mp17的长度是7238个核苷酸，而各片段的大约长度a是32;b是670;C是1640;d是4890;b+c是2300;a+b+d是5600个核苷酸。该图没有按比例绘制。(b)靶序列的选择应用威斯康辛大学遗传计算机组合在DESCSVAX 7800的计算机程序(Devereux等人，核酸研究12∶387-375 1984)，已经发现在M13mp7 SS DNA的14-核苷酸序列，它满足了下列标准(ⅰ)它是独特的，(ⅱ)在噬菌内DNA中没有出现具有一个、两个或三个失配的相似序列，(ⅲ)在噬菌体中没有出现具有0-2失配的互补序列，以及(ⅳ)在选择的序列中的切口和在参考的EcoRⅠ位点上的切口(见在图3中的切口Ⅰ及EcoRⅠ)会产生两个易于在硅胶上分辨及量度的片段(略去由EcoRⅠ切下的32-核苷酸发夹片段)。选择出一个14-核苷酸单独的序列5′-TGCTACCCTCGTTC-3′(核苷酸1339-1352)，与在M13mp7 SS DNA上没有发现有0-3核苷酸错配，以及仅有3个分散的4-核苷酸错配(在1749，2908及5599处开始)，和没有0-2核苷酸-错配-互补序列(它可能已为配对的接合体所干扰)。唯一的3-核苷酸错配互补序列在核苷酸5443处开始。(c)限制性酶的选择测试市场上可买到的所有类-ⅡS酶类显示，其中有四种酶(FokⅠ，HphⅠ，MboⅡ及BbvⅠ)对SS M13mp7(图4)不显示核酸内切分离的活性(endonucleolytic activity)。图4说明复制形式RF ds(第1，3，5，7，9，11，13道)和SS(第2，4，6，8，10，12，14道)M13mp7 DNA被FokⅠ(8u;第1，2道)，HphⅠ(8u;第3，4道)，HpaⅠ(2u;第5，6道)，MboⅡ(20u;第7，8道)，MnlⅠ(2u;第9，10道)，SfaNⅠ(2u;第11，12道)及BbvⅠ(2u;第13，14道)裂解。所有的酶均由New England Biolabs赠送。在ds DNA制造者建议的条件下，应用所指示的酶单位数(u;见上文的括弧中)每20微升消化混合物每2微克DNA，在37℃下进行消化作用3小时。样品制备及SS M13mp7 DNA的电泳条件与下文关于图6的叙述相同。样品的制备及dsDNAs的消化作用的条件与Maniatis等人(1982)所叙述的相同。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色并应用紫外光穿透-照明摄影DNA。由于在第一阶段FokⅠ受过挑选，因为先前对于此种酶的经验，及因为一种FokⅠ甲基化酶已经面市，使得有可能在预先存在的限制性位点保护ds DNA免受FokⅠ消化。如在图4中所见，类-ⅡS酶类HgaⅠ及MnlI显示在M13mp7 SS DNA上的多种切割，而SfaNⅠ似乎含有某些对于SS DNA为非特异性的核酸内切分离的活性(endonucleolytic activity)。所有7种酶都显示预期的ds切割，而除了MboⅡ之外，在这方面Dam甲基化作用妨碍了少数的切割(见Kessler等人，supra)。(d)接合体的设计由于FokⅠ识别序列GGATGCCTAC是不对称的，如在图2中所表示及解释的，建造了两种不同的寡脱氧核苷酸接合体，“左边”(32核苷酸)及“右边”(34核苷酸)。预期它们在M13mp7靶SS DNA上支配两种不同的切割，相距8个核苷酸(图2和3)。该结合体由两个区域组成(见图1)(ⅰ)含有FokⅠ-识别ds位点的恒定的ds(发夹)区域，及(ⅱ)在上文b段中叙述的，与靶序列互补的不同的SS区。左边的接合体，与在其3′末端的发夹结构，使得有可能进行两步合成(ⅰ)第一步，以被护形式大量供给恒定的ds区域，由3′-端至5′-端的有机合成，及(ⅱ)接着加入一些预先设计好的与所选择的靶序列互补的SS区域。适当的接合体与在其5′末端的发夹ds区域，使得有可能用其3′末端作为合成M13mp7 DNA的整个互补链的引物。(e)接合体的确定如在图5中所见，接合体能以一种发夹单体存在(见图2)或者形成一个二聚体，如下列，它与适当的接合体相对应5′-CACATCCGTGCACGGATGTGGAACGAGGGTAGCA-3′3′ACGATGGGAGCAAGGTGTAGGCACGTGCCTACAC-5′以中央的20-碱基对其回文结构对几种限制性酶(包括HgiAⅠ及Bsp1286)敏感。当在不发生变性的条件下进行电泳(图5，A-道1及B-道1)可观察到二聚体。当使用碱性样品混合物或在填充的缓冲液中以70℃处理时，二聚体的带即消失(图5B，分别于第2道及第3道)。在FokⅠ缓冲液中，在70℃变性的34-单体部份是可逆的(图5A第3道)。单体与二聚体两者都应具有接合体活性。(f)接合体对FokⅠ酶的敏感性由于期望FokⅠ酶只切割由于M13靶序列与接合体之间通过退火而形成的复式结构，有必要显示在互补的DNA链不存在时;该酶不会裂解接合体的SS区域。图5说明接合体的结构及它对FokⅠ裂解的不敏感性。在图5a中，所有的道都含有悬浮于FokⅠ缓冲液中的1克34-核苷酸接合体(见图6)并在70℃加热5分钟(第3-4道)或不用热处理(第1-2道)。在第2与4道中的接合体以FokⅠ处理(如与图6有关的叙述)。在20%聚酰胺凝胶上，在三-硼酸盐(Peacock)缓冲液(Maniatis等人，1982)存在下进行电泳5小时(电压为200伏)。每一个槽都装入20微升接合体溶液及5微升含有溴酚蓝的填充缓冲液(Maniatis等人，1982)。在图5b中，所有的电泳道都含有悬浮于20微升填充缓冲液(10%甘油，7%蔗糖，2.4%聚蔗糖(Ficol);不含溴酚蓝)-第1和2道;或悬浮于20微升碱性填充缓冲液中-第3道中的2微克的32-核苷酸接合体。将在第2道中的样品在70℃加热5分钟。样品(20微升)的电泳与在底板A上相同。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓对所得的带染色并如图4摄象。(a)二聚体，(b)单体，(c)溴酚蓝指示剂。由于单独的结合体不会被FokⅠ裂解，故提供了在图5A中显示的情况(第2及4道)。正如上文(d)段中所述，可观察到接合体分子的二聚化作用。(g)在SS M13mp7 DNA中裂解的监测应用琼脂糖凝胶(1.4%)电泳监测SS环状DNA的裂解(如Been与Champoux，酶学的方法，101∶90-98，1983所叙述)。单独的切割将DNA环转变为线性DNA，它的移行比封闭的环快些(图6;由CF转变为LF)。由于在M13mp7 DNA上的重复逆转而形成的发夹上有一个EcoRⅠ位点，将用EcoRⅠ进行的消化作用作为对照(图3)。实施例Ⅱ本例叙述应用酶-接合体复合物在一个预定的位点上裂解SS DNA(a)应用FokⅠ限制性酶在左边(32-单体)及右边(34-单体)接合体的存在下，M13mp7 SS环状DNA的消化作用图6说明在平面的1.4%琼脂糖凝胶的三-硼酸盐(Peacoak)缓冲液中，以120伏电压对线性及环状形式的M13mp7 SS DNA进行电泳分离3小时，而且通常接着进行Been及Champoux，supra的工艺程序。M13mp7 SS环状DNA可用Maniatis等人(1982)所叙述的方法制备。每一条道含有2微克的这种DNA(ⅰ)悬浮在总体积为20微升的FokⅠ缓冲液中(20毫克分子KCl，10毫克分子三·盐酸缓冲液，pH7.5，10毫克分子氯化镁，0.5毫克分子二硫苏糖醇(DTT)，(ⅱ)消化的或其他的处理，(ⅲ)在-70℃，在0.3M的乙酸钠存在下，用4体积的95%乙醇沉淀10分钟，在微型离心机中离心10分钟，(Ⅳ)用70%乙醇洗涤并在真空中干燥，再悬浮于20微升碱性样品混合物(30毫克分子NaOH，2毫克分子EDTA，7%聚蔗糖(Ficoll)，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)及0.01%的溴酚盐)中。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓使DNA带染色(见图4)。第1道(图6)含有未处理过的M13mp7 DNA〔上部的带，环状的形式(CF)高于90%而下部的带，线性的形式(LF)少于10%〕。第2道含有在37℃，在FokⅠ缓冲液中以12单位FokⅠ/20微升处理2小时的相同的DNA(见上文)。第3与4道含有分别由15-倍克分子过量的32-单体与34-单体接合体杂交的相同的DNA。杂交的过程包括在70℃加热5分钟，接着在F...
【专利技术属性】
技术研发人员：瓦克劳西巴尔斯基，
申请(专利权)人：瓦克劳西巴尔斯基，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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