浓缩和分离人尿中的胰蛋白酶抑制剂及胰激肽原酶的方法技术

人尿中二种成分，胰蛋白酶抑制剂和胰激肽原酶采用使人尿呈中性ｐＨ并收集气泡来浓缩。这样得到二种成分的浓缩物，调节浓缩物呈弱酸性，使酸性浓缩物与聚氨基葡糖接触，使二种成分吸附到聚氨基葡糖上，用氨水溶液从吸附剂上洗脱，调成中性并在约６０℃下加热１０小时以使洗脱液无病毒，然后再从洗脱液中分离二种成分。（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于以工业规模生产人尿胰蛋白酶抑制剂(此后简写为“HUTI”)和人尿胰激肽原酶(此后简写为“HUKN”)的方法，并通过把尿中所含的HUTI和HUKN同时浓缩来提高产量。尿胰蛋白酶抑制剂是一种在哺乳动物尿中所含有的酶活性的抑制剂，已知它的特性的变化依赖于提取它时所用动物的品种。〔Carlson，Enzyme，18，176(1974)〕。HUTI是分子量为68000，等电点为pH2-3的一种糖蛋白，特异地抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶〔Sumi，et al.，Journal of Physiol·of Japau，39，53(1977)〕，人弹性蛋白酶〔Johnson et al.，Hoppe Seyler′s Z.Physiol.Chem.，363，1167(1982)〕等，并可被视为一种消炎药而应用。另一方面，胰激肽原酶是一种蛋白溶解酶，它产生于活的动物体的各部位，通过对血清中激肽原的分解，产生激肽素，而显示各种不同的活性，例如降血压和增加血流量的活性。迄今为止，这二种物质由除人以外的不同动物中分离出来，并试图把它们用作药物。特别是目前已经用猪胰和尿作为天然原料生产出胰激肽原酶。然而，对人来说这些是外源蛋白质，具有抗原性，当它们用于临床时，多次使用常发生过敏反应，因此从安全性观点来看已经遇到了问题。与此对比，HUTI和HUKN是人源的蛋白质，因此对人体完全不会产生上述的副作用。作为HUTI的常规浓缩纯化方法，可能被提到过，例如联合使用三氯醋酸、硫酸铵和甲醇的沉淀方法〔N.R.ShulmanJ.B.C，213，655(1955)〕，采用斑脱土的方法〔T.A.StrupScan.J.Clin.Lab.Invest.，11，181(1959)〕和用DEAE一纤维素的方法〔G.J.ProkschJ.Lab & Clin.Med.，79，491(1972)〕。关于常规浓缩纯化HUKN的方法已知的如用硅胶的方法(已公布的日本专利申请第99151号/1980)和采用微孔型离子交换树脂，象WA-30的方法(已公布日本专利申请第5515号/1975)以及由本专利技术者建立的用聚氨基葡糖作为吸附剂所组成的浓缩纯化HUKNR的方法(已公布的日本专利申请第6883号/1984)。此外，同时浓缩HUTI和HUKN的方法是Sumi等所知道的用精氨酸-琼脂糖的方法〔Sumi，等Medicine and Biology(“Igaka to Seibutsugaku”)，Vol.100(1)(1980)〕。关于上面所提及的方法，这些方法试图用于HUTI或HUKN单个纯化和制备，但在成本化费和操作方面总不能满意，而同时浓缩两种物质的方法由于需要昂贵的吸附剂，操作过程太复杂以至在工业生产中不能实施。本专利技术者根据这样的事实，即在尿中所含的作为有活性的组分的HUTI和HUKN是两性蛋白，想出一个产生气泡的主意，并使这些组分停留在气泡上而实现浓缩。该方法已被用来浓缩尿激酶，即一种尿酶(Celander，DR，Langlinais，R.P.and Guest，M.M;Areh.Biochem.Biophys.，55，286(1955)〕，但从来没有用作浓缩尿胰激肽原酶和尿胰蛋白酶抑制剂的方法。因此，在不同的PH值下产生连串气泡来浓缩尿，而浓缩后的尿对HUTI和HUKN的回收率作比较研究。在检测尿PH时，下列两个因素需要考虑(1)当PH保持在5.0以下时，HUTI降解成低分子量组分;(2)HUKN在PH4.0以下时，不稳定。鉴于上述原因，一份60升尿分成10升一份，用6N-HCl或6N-NaoH调PH为5.0到10.0(不管沉淀在何时分出来，随时被移去)，然后分别装入直径为14厘米，高为100厘米的柱内(在每个柱的下凸缘装有一个孔径为5mm的多孔板);借助于压缩泵，把空气引进柱内，产生小气泡，收集溢流出柱子的气泡，回收浓缩尿约2升，计算HUTI和HUKN的回收率，所得结果见表1。表1.产率与PH值的关系产率pHHUTI HUKN5 62% 58%6 74% 78%7 85% 88%8 69% 71%9 58% 53%10 40% 38%注PH在8.0以上时，尿产生粘多糖沉淀，沉淀移去后，气泡才有效。计算回收率以未调PH以前原尿中的HUTI和HUKN的活性为100%。以上结果表明，当PH值为6.0-8.0时，气泡最为有效，最好是在7.0附近，而完成浓缩的时刻是在浓缩物的体积相当于未处理的原尿液的1/5时，可以用有效方法回收HUTI和HUKN(在此情况下，尿胃蛋白酶不被浓缩，发现其浓度与未处理的尿中一样)。本专利技术者进行进一步研究，用此浓缩的尿，通过下面的程序，在各种无机吸附剂、离子交换材料和蛋白凝结剂上通过对HUTI和HUKN的吸附进行纯化程度的比较研究。用每种上述材料处理浓缩过的尿，(1)2%浓缩过的尿加到每种材料上，(2)PH维持在5.0以上，以防止存在于浓缩尿中的尿胃蛋白酶使HUTI降解成低分子量组分。经过与上述类似的程序，75升尿被浓缩成15升浓缩尿(由此发现HUTI和HUKN的回收率分别为84%和89%)。浓缩尿分成一升一份，用20克每种材料进行吸附，然后洗脱。洗脱液用水充分透析，测定透析后的洗脱液中HUTI、HUKN和蛋白质的含量。计算它们在浓缩尿中的回收率以及比活性，结果见表2。表2筛选用于HUTI和HUKN的吸附材料试验产率(%) 比活性＊号 吸附剂 洗脱液 提供者PH HUTI HUKN HUTI HUKN1 高岭土 5.0 2%氨水 4 32 128 6.5 WaKo1)2 斑脱土 5.0 2%氨水 63 3 150 2.3 ″3酸性粘土 ″ ″ 34 28 121 3.1 ″4 硅胶 ″ ″ 0 51 - 9.0 ″5活化氢氧 ″ ″ 5 10 102 3.2 ″化铝6聚氨基葡糖 ″ ″ 71 83 311 8.7 Kyowa2)7Amberlite 7.0 ″ 30 21 77 3.4 Rohm &XAD-7 Haas8DEAE- ″ 0.1MH3PO451 55 146 4.8 Braun &纤维素 -0.5MNaCl Co.(W.G.)pH7.59DEAE- ″ ″ 42 60 121 4.3Pharmacia葡聚糖 Japan10QAE- ″ ″ 62 41 159 3.3 ″葡聚糖11精氨酸- ″ 2%氨水 62 60 205 6.6 ″琼脂糖注＊)以单位/毫克(蛋白质)本文档来自技高网...

【技术保护点】
在浓缩和分离人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿胰激肽原酶的方法中，方法由下列内容组成：在中性附近ｐＨ中，使人尿气泡化，收集所得气泡同时浓缩人尿中胰蛋白酶抑制剂和胰激肽原酶，把浓缩物调整到弱酸性，使酸性浓缩物与聚氨基葡糖接触，从二种成分同时吸附到聚氨基葡糖上，然后用氨水溶液从吸附剂上同时洗脱二种成分，中和洗脱液，在６０℃热处理中性洗脱液１０小时，如果需要，从热处理洗脱液中继续分离二种成分。

【技术特征摘要】
1.在浓缩和分离人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿胰激肽原酶的方法中，方法由下列内容组成在中性附近pH中，使人尿气泡化，收集所得气泡同时浓缩人尿中胰蛋白酶抑制剂和胰激肽原酶，把浓缩物调整到弱酸性，使酸性浓缩物与聚氨基葡糖接触，使二种成分同时吸附到聚氨基葡糖上，然后用氨水溶液从吸附剂上同时洗脱二种成分，中和洗脱液，在60℃热处理中性洗脱液10小时，如果需要，从热处理洗脱液中继续分离二种成分。2.根据权利要求1中所述的方法，使人尿在PH6.0到8.0中气泡化，最好是PH7。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：幸义和，中西晃一郎，平谷一，佐和佳代子，
申请(专利权)人：日本化学研究株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]