人溶菌酶的生产制造技术

公开了一种ＤＮＡ序列，其中编码信号肽并具有下述结构：Ｍ－Ｒ－Ｓ－Ｆ－Ｌ－Ｌ－Ｆ－Ａ－Ｌ－Ｃ－Ｆ－Ｌ－Ｐ－Ｌ－Ａ－Ａ－Ｌ－Ｇ的ＤＮＡ段结合于编码人溶菌酶的ＤＮＡ段的５端，还公开了一种用上述ＤＮＡ序列转化的细胞和生产人溶菌酶的方法，该方法包括培养上述在培养物中积累人溶菌酶的细胞并对人溶菌酶进行回收等。上述技术使得大量生产可作为药物使用的人溶菌酶成为可能。对于通过分沁生产人溶菌酶来说，本发明专利技术的信号肽优于鸡蛋清溶菌酶的信号肽。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生产人溶菌酶的DNA重组技术。更具体地说，本专利技术涉及人溶菌酶基因的表达、重组质粒、转化细胞及其产物。溶菌酶是一种较小的酶蛋白，分子量约为14，000。溶菌酶分布于活体组织中，人们认为它是作为防御物质而起作用的，它通过溶解各种细菌而抵抗细菌感染。溶菌酶的功能可能是通过β-葡糖苷酶活性来溶解细菌细胞壁的多糖。鸡蛋清中含有大量溶菌酶，因此从其中能够比较容易地分离到高纯度的溶菌酶。这样的溶菌酶可为了防腐目的加到干酪、香肠和海产品中，或用于将牛奶转化成人的哺乳奶(Katsuya Hayashi和Taiji Imofo，《溶菌酶》，Nankodo，Japan，1974)。而且，溶菌酶作为医疗药剂可用于止血、消炎、组织再生和抗肿瘤等(参见“Saikin-no-Shinyaku”(日本新药)Vol.34.107，Yakuji Nippo，Tokyo，Japan，1983)，并且，它已经作为消炎酶药剂上市了。将来自鸡蛋清的溶菌酶用于医疗目的时，通常导致过敏症状如疹子和发红等。这些现象一般称为对外源蛋白免疫应答的副作用。为了克服上述弊病，本专利技术者开始了研究以建立一种大量生产人溶菌酶的方法。人溶菌酶的氨基酸序列是已知的，它由130个氨基酸组成(“Biochemical Data Book”，1189，1979，日本生化学会主编)。以此氨基酸序列为基础，化学合成了编码人溶菌酶的DNA片段(Ikehara，M.等人，Chem.Pharm.Bull.，342202，1986)。为了利用DNA重组技术生产人溶菌酶，Muraki等人试图在大肠杆菌中进行表达，但用这种表达系统没能得到活性人溶菌酶(Muraki，M等人，Agric.Biol.Chem.，50713，1986)。已经发现，通过酵母的分泌作用得到了一种活性人溶菌酶(Jigami等人，《1986年日本农业化学学会概要》，P.343，1986)。但其产量非常低，只有600微克/升。根据Jigami等人的报道，在人溶菌酶的表达中，与编码人溶菌酶的DNA片段相结合，使用了一种编码信号肽的CDNA片段，此信号肽具有将所需蛋白分泌到细胞外的信息。作为编码信号肽的CDNA片段，使用的是编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的CDNA片段(天然型)(此信号肽的序列与Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775759-5763，1980中公开的相同)。然而，进行了这样的结合后，如上所述，从酵母细胞中分泌到胞外的溶菌酶数量仍然很少。本专利技术者利用DNA重组技术对于活性人溶菌酶的大规模生产进行了详尽的研究，研究结果是完成了本专利技术。虽然，人溶菌酶基因目前还未被克隆，但已经确定了溶菌酶的氨基酸序列。因此，以此氨基酸序列为基础，Ikehara等人已经化学合成了编码人溶菌酶的DNA(Ikehara，M.等人，同上)。因此，有可能利用此化学合成的DNA通过DNA重组技术大量生产人溶菌酶。作为与编码人溶菌酶的DNA片段一起使用的编码信号肽的DNA片段，可以提及的有编码下述结构式的信号肽的DNA片段M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G考虑到要在酵母中进行表达，因此，最好是利用酵母中高频率使用的密码制备编码蛋清溶菌酶信号肽的DNA片段。使用这样的DNA片段，发现能以增加的水平达到大量获取人溶菌酶的预定目标。密码子使用率已有过报道(J.Biol.Chem.，2573026-3031，1982)。优选的酵母密码子的实例在下面以RNA密码子的形式给出。氨基酸 密码子 氨基酸 密码子 氨基酸 密码子Ala GCU，GCC His CAC Tyr UACSer UCU，UCC Glu GAA Cys UGUThr ACU，ACC Gly GGU Asn AACVal GUU，GUC Gln CAA Pro CCAIle AUU，AUC Lys AAG Met AUGAsp GAC Leu UUG Trp UGGPhe UUC Arg AGA图1给出了通过寡聚核苷酸的集中和连接合成人溶菌酶基因的方法的示意图;图2表明人溶菌酶基因中TaqⅠ-XhoⅠ片段的DNA序列;图3表明信号肽的DNA序列;图4是构建人溶菌酶分泌质粒的示意图;根据Ikehara等人制备合成基因时，DNA序列的选择要考虑到下述因素1)使用最适于酵母的且被认为适于合成基因表达的密码子，2)造成一个限制性酶(此处是XbaⅠ)的专一性识别位点，它可作为克隆的标记使用，或有助于表达载体建成后的基因的再构建，3)避免在单链或双链中的自我互补或互相互补的序列(适当组合者除外)。人溶菌酶基因可以根据上述进行化学合成。必须将合成基因插入适当的载体中，以通过再克服使它增殖。虽然，只要能插入此基因的任何载体都可使用，但这儿引用几个具体的实例大肠杆菌载体pACYC 177、大肠杆菌-酵母穿梭载体pPH017、pGLD906和pGLD906-1(日本专利，未审查公开号为61-43991)、枯草杆菌(Bacillus Subtilis)载体pTEX201(Yoshimura，K.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，23250，1986)。利用含有这样得到的合成基因的载体转化各种宿主生物。转化本身的方法是众所周知的，但如果使用大肠杆菌作为宿主生物，则根据Cohen等人的方法进行转化(Cohen，S.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692110，1972)，如果使用酵母作为宿主生物，则使用Hinnen等人的方法(Hinnen.A等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751927，1978)，如果使用枯草杆菌作为宿主生物，则利用原生质体法(Chang，S.和Cohen，S.N.，Gen.Genet.，168111，1979)或感受态法(Dubnau，D.和Abelson，R.D.，J.Mol.Biol.，56209，1971)。作为宿主生物，可以使用的有例如大肠杆菌294、大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600、啤酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)AH22R-、枯草杆菌1A1、枯草杆菌1A339和枯草杆菌1A340等。然后，为了表达此基因，首先通过例如碱性提取法(Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic Acids Res.，71513 1979)从转化体中分离插入了基因的质粒DNA。通过用合适的限制性酶处理所得到的质粒DNA，可以将插入的基因切出来，并可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。所有这些方法都是已知的并在文献中有详细记载(参见例如《分子克隆》，1982，冷泉港实验室)。将分离的基因以正确定向连接到一个合适的表达载体中，使它位于启动子和信号肽编码区的下游，从而建成一个表达质粒。作为编码信号肽的优选的DNA，可以提及的有根据酵母密码本化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ序列，其中一个编码信号肽并具有下述结构：Ｍ－Ｒ－Ｓ－Ｆ－Ｌ－Ｌ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｃ－Ｆ－Ｌ－Ｐ－Ｌ－Ａ－Ａ－Ｌ－Ｇ的ＤＮＡ片段连接于编码人溶菌酶ＤＮＡ段的５′。

【技术特征摘要】
JP 1986-6-30 151809/86;JP 1986-8-20 192639/86;JP 11.一种DNA序列，其中一个编码信号肽并具有下述结构M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G的DNA片段连接于编码人溶菌酶DNA段的5′。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：菊池正和，吉村浩二，中滨一雄，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]