人红血球生成素基因的ＡｐａⅠ限制片段，可以从稳定转染的细胞系中生产高滴度的有生物活力的激素。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般地涉及基因工程领域，具体说与重组基因的糖蛋白产物表达有关，更具体地说与从稳定转染的细胞中高水平地表达有生物活力的人红血球生成素有关。红血球生成素这一激素在调节红血球生成、红血细胞的形成以及由贫血导致的红血球生成素缺乏中起着重要作用。由于缺少纯的材料，对这个激素做详细研究以及试图用它进行替补治疗一直都很困难。人红血细胞的产生，需要肾脏分泌成熟糖蛋白形式的红血球生成素。在恒态时，这个激素在循环血液中浓度为每毫升10至18毫单位(128-230微微克)，在严重的组织供氧不足(缺氧)刺激下，它的水平可以增加一千倍。提高激素水平可触发骨髓中感受干细胞群的增生和分化，激活成熟红细胞中血红蛋白的合成，加速红细胞从骨髓释放进入循环，从而增加红细胞量，改善供氧不足的局面。缺乏红血球生成素的病人如慢性肾脏病人，常患有严重的贫血症。红血球生成素是一个34-38千道尔顿的糖蛋白，分子量的约40%是糖类提供的。至少一个二硫桥是活力所需的，对此激素的结构所知甚少，其合成的详情也未全清楚。最近分离到的CDNA和基因组克隆，提供了分析红血球生成素产生的调节控制的机会，但是，还没有表达足够数量的有生物活力的人红血球生成素以用于替补治疗。按照本专利技术公开的内容，有生物活力的人红血球生成素可以由稳定转染的哺乳动物细胞系进行高水平表达(每升上清液超过二百万名义滴度单位)，这就为临床应用纯的人红血球生成素提供了巨大的来源。红血球生成素的这一惊人的高水平表达，是通过用人红血球生成素基团的ApaⅠ限制片段转染宿主细胞系实现的。ApaⅠ限制片段的意义链有图1所示的核苷酸序列。图1表示含有人红血球生成素基因序列的2426个碱基对的ApaⅠ限制片段;图2绘出了含有比2426个碱基对的ApaⅠ限制片段的有代表性的质粒表达载体(pD11-Ep);图3描绘的是另一个带有ApaⅠ限制片段的表达载体(pBD-Ep)。在较好的实施方案中，如图1所示的通过基因工程构建的ApaⅠ限制片段被插入如图2和图3所示的哺乳动物表达载体中，然后将表达载体引入哺乳动物细胞系以发展稳定转染的细胞，产生大量有生物活力的人红血球生成素。所选择的人红血球生成素基因的ApaⅠ限制片段要能最高效率地转录红血球生成素信使RNA，有效地转译RNA和进行转译后的修饰，以生成具有生物活力的成熟红血球生成素糖蛋白。具体地说，重要的是将红血球生成素基因5′端干扰序列除去，而保留增强子序列。为了保存有潜在价值的增强子序列，ApaⅠ限制片段中的内含子也被保留。在基因的3′端某些非转译序列也被保留， 使推测的调控序列最适化。由ApaⅠ片段提供的增强表达为以下实例所证实，在下述实例中，该片段与两个启动子和两个细胞系合用均得到稳定的高水平表达的红血球生成素。提出下列实例是用以阐述专利技术的优越性，并帮助普通的专门技术人员掌握和应用本专利技术。这些实例无论如何都不是企图限制本专利技术公开的范围，或本专利证书所提供的保护。实例1.基因克隆的提取在λ噬菌体中构建的人基因组文库(Cell，151157-1174，1978)用低严紧度杂交条件及在Cell，38287-297，1984(特此引证)中所述的寡核苷酸探针混合物进行筛选。寡核苷酸混合物系用Applied Biosystems合成仪制备，用32P-ATP及T4多核苷酸激酶作末端标记。设计的合成寡核苷酸相应于氨基末端部分的氨基酸序列H2N-Ala-Pro- -Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu- -Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala24此序列得自Yanagawa等人(J.Biol.Chem.2592707-2710，1984)从再生障碍贫血病人尿中纯化的人蛋白质。为了减少这段氨基酸序列密码子的简并程度，采用了Grantham等(Nucleic Acids Research，843-59，1981)和Jaye等(Nucleic Acids Research，112325-2335，1983)的密码子使用规律。这些规律考虑到了脊椎动物DNA中二核苷酸CpG相对地稀少，和适当地避免A∶G潜在错配。第24位氨基酸最可能是门冬酰胺(J.Biol.Chem.259∶2707-2710，1984)。对于氨基酸序列谷-丙-赖-谷-丙-谷-门冬酰胺，2组各72种相应于预期的密码子序列被合成，第一组是20核苷酸探针，为TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)-GCTTC，第二组在第18位将T换为C。对于氨基酸序列谷-门冬酰胺-异亮-苏-门冬-甘，构建一组序列为AGC TCC TCC ATC AGT ATT ATT T(c/t)的23核苷酸探针。用寡核苷酸探针杂交到的噬菌斑，于低密度下重筛选直到纯化。在起始的阳性噬菌体克隆通过噬菌斑纯化后，Jacobs等发表了红血球生成素基因的进一步的序列资料(Nature，313806-810，1985)。根据这一资料构建了寡核苷酸，并用于验证阳性克隆，用EcoRⅠ限制性酶酶解阳性克隆，用凝胶电泳纯化其插入片段，再用标准技术连结入预先用EcoRⅠ限制性酶解的pUC13质粒中。借助双脱氧核苷酸链终止法测定DNA序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467，1977)，此测定使用dATP(α-35S)和通用的17核苷酸引物，或在选定的区域使用特殊的寡核苷酸引物进行。32P-ATP从ICN获得，酶从New England Biolabs或Bethesda Research Laboratories获得。大约4.8×106个噬菌体被双份硝酸纤维素滤膜杂交法筛选。三个不同的克隆在噬菌斑纯化过程中保持阳性，其DNA插入片段作限制图谱和部分双脱氧序列测定。三个克隆中有两个显然含有红血球生成素基因的全部信息。这些克隆的限制图谱及其2426个碱基对的ApaⅠ片段的序列(见图1)与最近Jacobs等发表的人红血球生成素基因序列(Nature，313806-810，1985)基本相同。在这个增殖的文库中提出的含有红血球生成素基因的噬菌体频度之低-约2×106个噬菌体中有1个-与红血球生成素基因在人染色体基因组中以单拷贝存在的说法相符。用红血球生成素基因的ApaⅠ片段或其它限制片段与总人染色体DNA作Southern吸印杂交，只显现单一杂交区带，没有其它高度同源的DNA区域。实例2.ApaⅠ限制片段的选择为构建表达载体，红血球生成素基因的ApaⅠ限制片段按Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467，1977所述的技术(特此引证)制备得到。简言之，提出的噬菌体DNA用限制酶ApaⅠ(Bethesda Research Laboratories)酶解，然后在1%琼脂糖凝胶上分离，电泳洗脱，酚抽提和乙醇沉淀。此片段通过如实例1中的部分测序法验证。参照图1，插入的ApaⅠ限制片段含有58个碱基对的5′非翻译序列(0001-0058核苷酸)，后面是推测的27个氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
主要包含相当于人红血球生成素基因的ＡｐａＩ限制片段的基本纯的ＤＮＡ或ＲＮＡ。
【技术特征摘要】
US 1986-6-27 879,423及其等价部分所定义的内容加以限制。权利要求1.主要包含相当于人红血球生成素基因的ApaI限制片段的基本纯的DNA或RNA。2.权利要求1中的DNA或RNA，其ApaⅠ限制片段主要包含如图1所示的意义链的核苷酸序列，或其互补的RNA序列。3.权利要求1中的DNA或RNA序列，它们有效地与能够使其表达的第二核酸序列相连接。4.权利要求3的DNA或RNA，其中第二核酸序列由下列中选择一种或数种启动子序列、增强子序列、多聚腺苷酸序列、选择性标记序列、质粒、病毒或逆病毒表达载体、以及逆病毒的跨染色体作用因子。5.含有权利要求3的DNA或RNA的细胞。6.用权利要求3的DNA或RNA稳定转染的细胞。7.权利要求6的细胞，它们从包括真核细胞、酵母和细菌的一组中选出。8.权利要求7的细胞，其中真核细胞来源于肾脏。9.权利要求8的细胞，其中肾脏细胞是上皮细胞。10.一种表达有生物活力的重组人红血球生成素的方法，包括用主要含有人红血球生成素基因的ApaⅠ限制片段的DNA、RNA或核苷酸序列转染宿主细胞，使转染细胞与培养基相接触，使细胞表达红血球生成素，并回收表...
【专利技术属性】
技术研发人员：杰里S鲍威尔，
申请(专利权)人：华盛顿大学评议会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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