一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法技术

本发明专利技术公开了一种HPV分型及整合的高通量测序检测方法，本方法选取目前HPV亚型的基因，结合第二代高通量测序测序技术，更全面的检测患者感染HPV的类型，克服了传统检测方法准确率低、假阳性高、重复性差、漏诊率高等困难。在分子诊断领域，最直接而明确的技术是基因测序，第二代高通量测序测序技术比目前多采用经典的Sanger测序方法有检通量更大、测序速度更快、精确度更高、成本更低和信息量更丰富等优点。本方法在第二代高通量测序测序技术帮助下，可以对高危型HPV及低危型HPV进行精确分型并检测其是否发生人类基因组的整合，对检测者进行精确地个体化评估，预防病变发生的风险，从而预防肿瘤的发生。

【技术实现步骤摘要】
一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法
本专利技术涉及一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒（HPV）是一种小型DNA病毒，是一种嗜黏膜和皮肤上皮性病毒，具有高度特异性。HPV病毒，主要由DNA核心和蛋白衣壳组成。其基因组为双链环状DNA，长约7.5～8.0kb，含8个开放阅读框（openreadingframes,ORFs），依功能不同分3个区：（1）早期区（earlyregion,E区）：分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能；（2）晚期区（lateregion,L区）：编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2；（3）非编码区（uncodingregion,UCR）又称长控区（LCR）或上游调控区(URR)：含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。HPV的分类主要依据HPV病毒基因组中L1区的DNA同源性。目前已经发现了170多种HPV型，有40多种可感生殖腔。HPV可以引起人全身各部位的皮肤或者粘膜感染，导致多种上皮组织疾病。例如皮肤寻常疣，扁平疣，外生殖器的尖锐湿疣等。宫颈上皮组织长期感染的某些型别的HPV可能引起基因突变，导致宫颈上皮内增生和宫颈癌。宫颈癌发病率居全球女性恶性肿瘤的第2位，发病率仅次于乳腺癌，每年约有50万宫颈癌新发病例，其中约1/3为死亡病例。据统计中国每年宫颈癌新发病例约13.5万，发病率为14.6/10万。根据其导致宫颈癌风险的高低将这些HPV分为高危型和低危型。高危型HPV可能引发妇女发生宫颈癌．主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82等型别；低危型HPV主要引起尖锐湿疣，包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、81等型别。CP8304等亚型，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CINⅡ/Ⅲ）的发生相关，尤其是HPV16和18型。HPV感染是宫颈癌发生的主要病因，持续高危型HPV的感染是癌前病变和浸润性宫颈癌发展的必要因素。由于不同亚型HPV的致病机制、致癌危险性及感染后的预后各不相同，因此对HPV各亚型进行分型以及是否整合到人类基因组上的检测有重要的临床意义。因此，临床上有必要建立一种简便、快速、灵敏、特异的分型及整合的检测方法。对HPV病毒感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性，同时改善妇女宫颈癌的防治。宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。传统上，宫颈涂片检测是群体筛查的常规手段，属于细胞学检测方法。实验室的技术人员会于显微镜下观察不正常的细胞以诊断病人的病情，但由于这方法只以观察作为诊断基础，受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，其准确率低，假阴性高，重复性差，得到的结果及分析漏诊率可达30%。在检查和筛选HPV的基因型方法中，实时荧光PCR法及杂交捕获法是最为常用的，但是对于不同种基因型HPV的诊断操作繁琐，检测通量低，难以满足临床上同时检测多个亚型的需要，不适合于对子宫颈癌的大规模筛查。商业化的杂交捕获法试剂盒无须PCR扩增即可检测出临床样品中的HPVDNA，并且可区别高危型和低危型两类，但是此类试剂盒无法鉴定出感染HPV的具体基因型及是否整合，其假阴性和假阳性较多，灵敏性和特异性有待提高。但在分子诊断领域，最直接而明确的技术是基因测序，传统的基因测序方法是通过Sanger终止法进行的，该方法一次只能读取单个基因的序列，而对于有众多基因亚型感染的疾病，很难获得理想的测序结果。现有的这些检测方法只能进行少量的HPV分型，而对于HPV是否整合到人类基因组上无法检测，而HPV是否整合到人类基因组上是发生HPV导致癌症的前提。第二代高通量测序测序技术实现了同时对几百万甚至数亿条DNA序列进行测序，具有费用低、通量高、速度快、灵敏度高及准确度高等优点，更重要的是可以在检测分型的同时，检测HPV是否整合到人类基因组上，以及整合的位点是否会导致癌症的发生。本专利在第二代高通量测序测序技术的帮助下，可以对高危型HPV及低危型HPV进行精确分型，并对HPV是否整合到人类基因组上，以及整合的位点是否会导致癌症的发生进行精确地个体化评估，预防病变发生的风险，从而预防肿瘤的发生。
技术实现思路
本专利技术提供一种准确度高、临床意义明确的HPV分型及整合检测方法。1.一种用于HPV分型及整合的检测方法，包括HPV分型及整合高通量测序测序检测方法。HPV分型及整合检测试剂盒的方法包括如下步骤：(1)根据HPV基因组，调取HPV基因组序列。常见HPV分型列表如下：HPV6HPV11HPV16HPV18HPV26HPV31HPV33HPV35HPV39HPV45HPV51HPV52HPV53HPV56HPV58HPV59HPV66HPV68HPV73HPV82HPV40HPV42HPV43HPV44HPV54HPV61HPV70HPV72HPV81调取包含列表不同亚型HPV基因组序列；(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作HPV基因扫描试剂盒;所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:从患者获取宫颈细胞样本并提取DNA，然后利用HPV基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序测序，进而分析，找出与HPV基因信息，从而得到患者HPV的基因型，以达到区分是否高危HPV及整合。根据权利要求1所述的一种用于HPV分型及整合的检测方法，采用测序仪进行高通量测序测序分析流程包括如下步骤:(1)测序仪(IlluminaNextseq500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;(2)用TrimGalore进行QC并去除低质量数据;(3)把短序列用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到相应的HPV基因组数据（例如Alphapapillomavirus7,Humanpapillomavirus18(HPV18),completegenomegi|60975|lcl|HPV18REF.1|HPV18REF）相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f);(4)使用PicardTools及自写脚本，针对不同样本不同类型的HPV基因进行归一化处理，统计相应的覆盖度及短序列数量，得到分型结果。所述基因整合分析流程包括如下步:(1)测序仪(IlluminaNextseq500)获取原始短序列;(2)用TrimGalore进行QC并去除低质量数据;(3)把短序列用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到HPV基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f);(4)用factera检测多个基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法，包括HPV分型及整合检测试剂盒以及检测方法。

【技术特征摘要】
1.一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法，包括HPV分型及整合检测试剂盒以及检测方法。2.HPV分型及整合检测试剂盒的方法包括如下步骤：(1)根据HPV基因组，调取HPV基因组序列；常见HPV分型列表如下：调取包含列表不同亚型HPV基因组序列；(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作HPV基因扫描试剂盒;所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:从患者获取宫颈细胞样本并提取DNA，然后利用HPV基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序测序，进而分析，找出与HPV基因信息，从而得到患者HPV的基因型，以达到区分是否高危HPV及是否整合到人类基因组上。3.根据权利要求1所述的一种用于HPV分型及整合的检测方法，采用测序仪进行高通量测序测序分析流程包括如下步骤:(1)测序仪(IlluminaNextseq500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;(2)用TrimGalore进行QC并去...

【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，叶建伟，王伟，
申请(专利权)人：嘉兴允英医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33