本发明专利技术涉及一种单克隆抗体或其片段，其特征在于，它具有与哺乳动物α６整合蛋白（优选人α６整合蛋白）结合和抑制转移的能力。本发明专利技术还涉及一种分泌上述抗体的杂交瘤细胞系，制备该杂交瘤细胞系和抗体的方法，含有该抗体或其片段的药物组合物，以及该抗体或其片段在治疗疾病尤其是癌症中的应用。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
侵入的癌细胞在血管内皮上的粘连，是转移过程中关键性的第一步，也是具有选择性的一步。在过去的几年中，已发现大量的不同粘连分子参与造血细胞的细胞迁移和返巢机理。转化的肿瘤细胞能以某种不受控制的方式明显误用这种机理，从而导致在不同于其原来所在组织的组织中发生转移。本专利技术的单克隆抗体具有抑制转移的特异能力，在这一基础上现已意外地发现，另一种称为α6整合蛋白(integrin)的分子(综述见Hemler，Annu.Rev.Immunol.8∶365-400，1990)，即这些单克隆抗体所识别的抗原，也可被认为是参与转移过程的内皮粘连分子，而且可能是最重要的内皮粘连分子。文献中已描述了针对α6整合蛋白链的三种其他抗体，它们的生产方法完全不同。抗体GoH3是通过用血小板免疫大鼠而产生的。选择这种抗体是因为它识别血小板蛋白复合物Ⅰc-Ⅱa，该复合物后来被定义为α6/β1整合蛋白(Sonnenberg等，J.Biol.Chem.26210376-10383，1987;Hemler等，J.Biol.Chem.2637660-7665，1988)。抗体135-13C是在大鼠体内针对纯化的肿瘤联结蛋白TSP-180制备的，该抗体现在被称作α6/β4整合蛋白(Kennel等，Cancer Res.413465-3470，1981;Kennel等，J.Biol.Chem.26415515-15521，1989)。最后，抗体GB36是在小鼠体内针对人胎盘微绒毛制备物而生产的。该抗体识别人癌细胞上的细胞表面蛋白(Hsi等，Placenta 8209-217，1987)。现已有人提出，所识别的蛋白(α6/β1整合蛋白)可能对维持细胞极性有作用，但尚未进行功能测定。癌、黑素瘤和内皮细胞能够与细胞外基质分子昆布氨酸粘连。包括α1/β1和α2/β1和α6/β1在内的几种整合蛋白复合物，参与介导这种结合作用。其中的一种整合蛋白即α6/β1，似乎能与昆布氨酸发生单特异性反应，而抗体GoH3则能阻断细胞-昆布氨酸相互作用，该抗体将α6整合蛋白确定为由弹性蛋白酶消化产物得到的E8片段的受体(Sonnenberg等，1990)。抗体135-13C也对细胞与昆布氨酸的结合有影响，但程度较低。本专利技术的抗体不干扰细胞与昆布氨酸的结合，但却阻断黑素瘤细胞与血管内皮细胞的细胞间相互作用。这一发现强烈提示，本专利技术的抗体识别α6整合蛋白链上的一个迄今为止尚属未知的结构域，这个结构域明显不同于GoH3、135-13C或GB36的结合位点。这可由如下事实进一步证实，即，GoH3与绵羊的皮肤返巢淋巴细胞发生交叉反应，而本专利技术的抗体则不然。因此，本专利技术的一个目的是提供一种单克隆抗体或其功能衍生物，尤其是Fab片段，其特征在于它能与哺乳动物(例如小鼠，优选人)的α6整合蛋白结合(抗α6整合蛋白单克隆抗体)，该抗体抑制转化细胞的转移，尤其是通过抑制转化细胞与血管内皮的相互作用。一般来说，这类转化细胞一方面是以带有α6整合蛋白作为表面分子为特征的细胞，例如黑素瘤、癌、T细胞淋巴瘤或肉瘤，优选黑素瘤和癌，尤其是黑素瘤;另一方面是带有迄今未确定的α6整合蛋白配体作为表面分子的细胞。本专利技术的另一个目的是，提供分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系，以及由这些细胞系分泌的单克隆抗体。按本专利技术所述获得的杂交瘤细胞系“F3C34”已保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)。本专利技术的另一个目的是提供上述单克隆抗体或其片段作为治疗剂，尤其是用于通过抑制转移而治疗癌症。与α6整合蛋白结合的抗体可以用某些短肽作起始抗原来制备，这些短肽的氨基酸顺序是由人α6整合蛋白的已知氨基酸顺序衍生的(Hogervorst等，Eurp.J.Biochem.199425-433，1991)。这些肽可以用肽和蛋白质化学合成领域内已知的方法来制备，例如用如Gross和Meyenhofer("The Peptide"，Vols.1-9，Academic Press，Inc.，Harcourt Brace Jovanovich，Publs.，San Diego，1979-1987)或Fields和Nobel(Int.J.Pept.Prot.Res.35161-214，1990)所述的部分或完全液相或固相合成法。然而，以这样一种方式制备的抗体并不一定与天然α6整合蛋白反应，也不一定具有本专利技术抗体的特定性质。所以，本专利技术的抗体可以由α6整合蛋白阳性细胞起始来制备，例如内皮细胞或内皮细胞来源的转化细胞，其中特别优选的是一种eEnd2细胞系。给非人类哺乳动物如小鼠、家兔、大鼠或绵羊注射上述抗原，就能用本领域已知的方法从血清中得到多克隆抗体。可以用以下方法制备单克隆抗体由上述免疫动物回收抗体生成细胞，并以常规方式使得到的所述细胞永久化，例如与骨髓瘤细胞(如PAI小鼠骨髓瘤细胞、SP2/0细胞或SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581;ATCC CRL8287))融合(关于抗体生产方法的一般性指导，参见例如冷泉港实验室的Harlow，E.和Lane，D.所编的《抗体-实验室手册》一书，冷泉港实验室出版社，1988)，或者如实施例Ⅰ所详述的那样制备单克隆抗体。接着，必须用某种测定法筛选出分泌本专利技术抗体的杂交瘤培养上清液，这种测定法测定的是本专利技术抗体的转移抑制性质，例如如实施例Ⅰ所详述的测定法。所以，本专利技术的又一个目的是，提供一种按本领域已知方法制备抗α6整合蛋白单克隆抗体及其片段的方法以及用这样一种方法制得的化合物，所述方法中，借助所述上清液中所含的抗体抑制转移的能力对所得的杂交瘤上清液进行筛选。可以用常规色谱法从杂交瘤上清液中纯化出抗α6整合蛋白单克隆抗体，例如象离子交换色谱、G蛋白亲和色谱、与固相载体结合的抗免疫球蛋白抗体或抗原或其一部分、HPLC等。为了按本领域公知的方法生产大量的抗α6整合蛋白单克隆抗体，可以给小鼠腹膜内注射分泌所需抗体的杂交瘤，小鼠在注射前已预先用(例如)朴日斯烷处理。这种腹水瘤在一只小鼠体内最多可产生100mg左右的单克隆抗体。可以用上述方法从腹水瘤所产生的腹水中纯化出抗体。本专利技术的抗体可以用已知方法按其亚型来鉴定，例如用乌赫特朗尼氏免疫扩散法。杂交瘤细胞系“F3C34”所分泌的抗体为IgG2a亚型。另外，本专利技术的抗体可以借助它们抑制转化细胞转移，尤其是抑制转化细胞与血管内皮相互作用的能力得到鉴定。这种活性可用本领域已知的测定法来测定，例如，在体外用实施例Ⅰ所述的测定法，或者在体内用实施例Ⅱ所述的测定法，在这些测定法中，可以根据转化细胞和本专利技术抗体能够与之结合的适宜组织材料(体外测定的情况)，以及转化细胞系在其体内诱发转移且本专利技术抗体能与其交叉反应的动物的类型，使用任何带有α6整合蛋白作为表面分子的转化细胞系，例如黑素瘤，如B16细胞(Vollmers等，Cell 40547-557，1985);癌，如KLN205(ATCC CRL1453)或CMT-93(ATCC CCL223)或MM45T(ATCC CRL6420);T细胞淋巴瘤，如BW5147(ATCC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备单克隆抗体或其功能衍生物的方法，该单克隆抗体或其功能衍生物的特征是具有与哺乳动物α６整合蛋白结合和抑制转移的能力，该方法的特征在于，给非人类哺乳动物注射α６整合蛋白阳性细胞作为起始抗原，由该免疫动物回收抗体生成细胞并以常规方式永久化，用测定转移抑制作用的测定法筛选所得的杂交瘤细胞系，从相应杂交瘤细胞系的上清液中分离所分泌的抗体，需要时用酶法或化学法进行水解。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：BA因姆霍夫，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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