用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法技术

一种用于基因工程的用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法，它组建了柞蚕核型多角体病毒表达载体，利用柞蚕蛹为活体宿主，将外源基因克隆到柞蚕ＮＰＶ表达载体后，将野生的ＡｐＮＰＶＤＮＡ与重组质粒ＤＮＡ一起转染柞蚕细脆或柞蚕蛹，形成载有外源基因的重组病毒，再将经纯化所得的重组病毒感染柞蚕蛹，即可在柞蚕蛹体内大量表达生产该基因产品。本发明专利技术采用柞蚕蛹作为活体宿主资源丰富稳定、可识别基因的信号序列，表达量高于苜蓿尺蠖１００倍以上。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种用于基因工程的用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法，它是将纯化的病毒粒子经抽提得到的ＡＰＮＰＶＤＮＡ进行限制性内切酶酶谱分析、琼脂糖凝胶电泳、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印，并用ＯｐＮＰＶ核多角体蛋白基因为探针进行分子杂交确定多角体蛋白基因在ＡｐＮＰＶ基因组中的位置，其特征在于：ａ．用大肠杆菌载体质粒（ＰＡＴ１５３、Ｐｕｃ１９）克隆、增殖所载该基因的ＤＮＡ片段为５′端的ＰｖｕⅡ－－ＢａｍＨⅠ片段和３′端的ＢａｍＨⅠ－－ＰｓｔⅠ片段，分别以单链ＤＮＡ和双链ＤＮＡ为模板采用双脱氧序列分析法对所克隆的ＤＮＡ片段进行核苷酸序列分析，读出柞蚕ＮＰＶ核多角体蛋白的基因的全编码序列７３５ｂｐ和其两侧翼区部分非编码序列，采用ＰｒｉｍｅｒＥｘｔｅｎｓｉｏｎ方法确定该基因ｍＲＮＡ转录起始点位于ｎｔ－－５０的Ａ位点，进而确定该基因的５′末端基因表达调控序列的位置；ｂ、采用人工合成寡核苷酸引物引导点突变及ＰＣＲ等技术将ＡｐＮＰＶ多角体蛋白基因的起始密码子去掉（ＡＴＧ突变为ＡＴＴ）同时分别切掉ｎｔ＋２～＋１４０、ｎｔ＋９～＋１４０和ｎｔ＋３７～＋１４０５′末端编码序列，组建了ＰＡＰＭ７４０、７４１、７４８和７３６等系列基因转移载体；ｃ、将外源基因分别克隆到所组建的四个载体中，抽提重组质粒ＤＮＡ，并与抽提的ＡｐＮＰＶＤＮＡ一起转染柞蚕卵巢细脆或柞蚕蛹，待柞蚕细胞或柞蚕蛹感染发病后取其病毒液分别用空斑法或末端稀释法分离外源基因重组病毒；ｄ将分离的重组病毒感染柞蚕蛹，经分离、纯化即可得到外源基因产物。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张春发，刘淑珊，范琦，李广泽，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]