一种肝细胞体外培养方法技术

技术编号:1735529 阅读:249 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及一种肝细胞体外培养方法。通过采用边条参液合成培养基,使培养方法简便易行,所需条件要求不高,培养出来的肝细胞活性良好、生物特性正常,适合于一般条件的实验室推广应用。(*该技术在2012年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种生物组织体外培养方法,特别是一种肝细胞的体外培养方法。肝脏是环境中多种有害因素作用的靶器官,用原代培养的肝细胞作外源性毒物、药物代谢研究,目前最有希望的是体外培养的哺乳动物肝细胞。现有的肝细胞体外培养均用体外肝灌流法,用昂贵的胶原酶消化制成肝细胞悬液,再用特定的培养基,在37℃ 5~10%的CO2培养箱中培养。由于方法复杂、混杂的纤维母细胞成分较多、且所需设备价格昂贵、来源困难,因而一般条件的实验室很难开展工作。本专利技术的目的在于提供一种能使肝细胞在体外良好增殖,且能抑制成纤维细胞过度生长的简便易行、无需昂贵仪器、设备、试剂即可实施的肝细胞体外培养方法。本专利技术的目的是通过采用边条参液合成培养基而实现的。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。边条参溶液合成培养基配方如下RPMI 1640 100ml青霉素 100U./ml链霉素 100mg/ml胰岛素 5mg/ml氢化可的松 10mg/ml10%边条参液 10mg/ml小牛血清占培养基总量的10%。用5.6%NaHCO3调pH至7.2~7.4。10%边条参液的制备方法称10g边条参剪成小片,加入双蒸水100ml,煮沸30分钟(补足其液量),2000转/分离心15分钟,取上清,经无菌过滤,-20℃保存备用。此培养基能为肝细胞在体外增殖提供良好的环境,且能抑制成纤维细胞的过度生长。具体培养方法如下1.取新生1~5天的SD大鼠2~3只,用碘酊酒精消毒皮肤,放血致死,无菌取肝。2.弃净肝包膜及髓质部分,用眼科镊子及剪刀作反复机械分离,小心分离肝组织。3.用无菌Hank′s液清洗,直至乳白色。4.用眼科剪刀轻轻剪碎,成为肝组织浆状,再用Hank′s液小心地清洗两次。(以上每次用Hank′s液清洗过程中,不用离心机沉淀,而用自然沉淀)。5.用0.25%胰蛋白酶,37℃水浴中消化30分钟,并不时摇动,使消化均匀。6.弃胰酶,用边条参液合成培养基将细胞团块轻轻打碎。7.用0.2%台酚兰计数死活细胞数,如活细胞数>90%则接种于已涂有鼠尾胶(已干,使用前用Hank′s液冲洗一次)的20ml组织培养瓶中,每瓶3ml,3.0×105/ml细胞。8.盖紧胶塞,37℃普通温箱培养。9.待细胞贴壁后,24小时后换上新的合成培养液,并可用普通光学显微镜将细胞面倒置起来,观察细胞生长情况。(代替倒置显微镜观察)10.肝细胞以小岛形式向四周扩展生长,约2~3周左右融合成单层。本专利技术方法简便,所需条件要求不高,且培养出来的肝细胞活性良好,生物学特性正常,适合于一般条件的实验室推广应用。权利要求1.,包括取肝、分离、清洗、沉淀、消化、培养、接种等步骤,其特征在于采用边条参液合成培养基培养肝细胞。2.根据权利要求1所述的肝细胞体外培养方法,其特征在于每毫升培养基中含青霉素100U、链霉素100mg、胰岛素5mg、氢化可的松10mg、10%边条参液10mg,小牛血清占培养基总量的10%。3.根据权利要求1或2所述的肝细胞体外培养方法,其特征在于培养基pH值为7.2~7.4。全文摘要本专利技术涉及。通过采用边条参液合成培养基,使培养方法简便易行,所需条件要求不高,培养出来的肝细胞活性良好、生物特性正常,适合于一般条件的实验室推广应用。文档编号C12N5/06GK1082109SQ9210889公开日1994年2月16日 申请日期1992年7月27日 优先权日1992年7月27日专利技术者潘姜萍 申请人:中山医科大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝细胞体外培养方法,包括取肝、分离、清洗、沉淀、消化、培养、接种等步骤,其特征在于采用边条参液合成培养基培养肝细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员:潘姜萍
申请(专利权)人:中山医科大学
类型:发明
国别省市:81[中国|广州]

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