一种蜘蛛细胞毒活性肽在抗肿瘤药物研发中的应用制造技术

一种蜘蛛细胞毒活性肽在抗肿瘤药物研发中的应用，从带斑狼蛛

Application of a kind of spider cytotoxic peptide in the research and development of antitumor drugs

Application of a spider cytotoxic peptide in the development of anticancer drugs in the spot from the tarantula

【技术实现步骤摘要】
一种蜘蛛细胞毒活性肽在抗肿瘤药物研发中的应用
本专利技术属于生物化学中的多肽药物
，具体涉及一种从带斑狼蛛Lycosavittata蜘蛛CDNA获得的抗癌肽在抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
在临床使用的多种抗癌药物的选择性低，副作用高已经对癌症患者产生了世界上的公共卫生产生了严重威胁。因此开发一种具备选择性，副作用小的药物变的十分迫切且成为了一个亟待解决的难题。而在开发新型抗癌药物方面，抗菌肽（ACPs）表现出的高选择性和高活性一度被认为是一个强有力的新型武器来对抗各种癌症。由于癌细胞膜与正常细胞膜的不同组成赋予了它一定选择性，且它的作用机制多样，杀死癌细胞迅速，不限于某个特定的靶点，使它不容易产生抗性。因此，获得具强抗癌活性的抗癌肽是非常值得追求的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在于提供一种具抗癌作用的多肽LVTX-VIII在抗癌和抗迁移方面的应用。上述专利技术目的是通过以下技术方案实现的:将从带斑狼蛛LycosavittatacDNA文库中设计出来的抗癌肽通过化学合成用于在抗肿瘤方面的研究。本专利技术提供的抗癌肽来自于带斑狼蛛Lycosavittata的蜘蛛cDNA文库，通过一系列的设计合成出的一种具有25个氨基酸残基的多肽，，命名为LVTX-VIII；该多肽的氨基酸序列为：IleTrpLeuThrAlaLeuLysPheLeuGlyLysAsnLeuGlyLysHisLeuAlaLysGlnGlnLeuSerLysLeu。所述的抗癌肽的分子量为2849.50Da(M+H+)，等电点10.6。通过本专利技术的抗菌实验充分表明，本专利技术的抗癌肽LVTX-VIII具有很强的抗癌活性，另外，还具还有很强的抗癌症迁移活性，可作为现有的抗癌药的替代药物或辅助药物。可有效解决一些传统药物低选择性和高副作用的问题，减轻癌症患者的痛苦。由于该多肽的强抗迁移活性也可以结合一些传统抗癌药物使用，减少传统药物使用量的同时还可以弥补传统药物缺乏抗肿瘤迁移作用的缺陷。Lycosavittata蜘蛛毒素抗癌肽LVTX-VIII的抗癌和抗迁移研究方法（1）LVTX-VIII的体外抗癌和抗迁移方法培养的A549,H460和HEK293T细胞经胰酶消化后，用含10%FBS的培养基重悬，抗迁移实验则用无血清培养基重悬，进行CCK-8实验测定和Transwell迁移侵袭实验测定。在CCK-8实验中，细胞以1×105的密度种于96空板中，LVTX-VIII以2倍梯度稀释加入空中，每个浓度设3个复孔，孵育24小时，加10μL的CCK-8孵育4小时，酶标仪测出吸光值（图1）。在Transwell迁移侵袭实验测定实验中，Transwell上室加入用无血清培养基重悬经药物处理过的细胞，下室加入含10%FBS的血清培养基，孵育8小时，固定，结晶紫染色，拍照统计细胞数量（图3）。（2）LVTX-VIII的体内抗癌和抗迁移方法荷瘤模型中通过皮下注射2×107的细胞使裸鼠成瘤，瘤体体积达到200mm3左右时，随机分组进行研究。迁移模型中经尾静脉注射5×106的细胞，裸鼠饲养5天观察其生存状况，随机分组用于进行迁移研究。2种模型的给药浓度为8mg/kg，每2天给药一次，给药方式均为腹腔注射。图3展示了构建完荷瘤模型的瘤体大小重量表征图，不同的细胞对LVTX-VIII的敏感性不同，相对于H460组，A549组的效果更加的明显一些，这可能与不同细胞亚系细胞的恶性程度有关。图5展示了构建完的迁移模型的肺部表征和生存率统计图。LVTX-VIII对于2种癌细胞的归巢能力均有抑制作用，更关键的是，药物能够大大的延长裸鼠的生存期限。这可能兼具不同的效应，血药浓度高时会使肿瘤细胞凋亡同时伴随着迁移力减弱的现象。低血药浓度时使肿瘤细胞的迁移能力受限，同时也会影响归巢细胞的集落形成，有效的遏制了肺部结节的发生发展。附图说明图1LVTX-VIII的细胞毒和凋亡图谱；图1A.LVTX-VIII对A549和H460的细胞毒作用；图1B.LVTX-VIII对HEK293T细胞毒作用；图1C.不同浓度的LVTX-VIII对A549和H460细胞的流式凋亡图。图2是LVTX-VIII的集落形成效应；图3LVTX-VIII对A549和H460细胞的迁移和侵袭作用图谱；图3A.不同浓度的LVTX-VIII对A549的迁移作用；图3B.对A549的侵袭作用；图3C.不同浓度的LVTX-VIII对H460的迁移作用；图3D.对H460的侵袭作用；图4LVTX-VIII在invivo水平抑制肿瘤生长；图4A.A549肿瘤移植裸鼠模型肿瘤大小图谱；图4B.H460肿瘤移植裸鼠模型肿瘤大小图谱；图4C,D.A549和H460肿瘤移植大小统计图；图4E,F.A549和H460肿瘤移植重量统计图；图5加药后A549和H460的肿瘤Tunel染色图谱；图6LVTX-VIII在invivo水平抑制肿瘤迁移；图6A，B.尾静脉注射A549和H460细胞的肺部解剖图；图6C,D.肺部结节统计图；图6E,F.尾静脉注射A549和H460迁移模型中裸鼠的生存率统计图；图7迁移模型中的肺部HE切片图；具体实施方式为了揭示LVTX-VIII的抗癌和抗迁移作用，我们在细胞水平和动物水平检测了LVTX-VIII对A549和H460种不同肺癌细胞的抑制特性，并对其相关的指标进行了统计和分析。实验的开展都是严格的根据临床和标准化研究所标准进行。1.主要材料和仪器细胞培养的相关试剂在赛默菲世尔公司购买，其余细胞实验相关试剂自生工。A549和H460细胞从中科院上海细胞库中购买。Transwell迁移和侵袭小室购买于Corning公司。裸鼠购买于斯莱克景达公司。2.实验方法和结果2.1LVTX-VIII的体外抗癌和抗迁移活性A549,H460和HEK293T细胞以1×105的密度种于96空板中，LVTX-VIII以2倍梯度稀释加入空中，每个浓度设3个复孔，孵育24小时，加10μL的CCK-8孵育4小时，酶标仪测出吸光值。如图1A-B所示，LVTX-VIII对2种癌细胞的半抑制浓度（IC50）在8μM左右。对HEK293T的IC50=19.205μM，具备一定的选择性。流式凋亡检测2种细胞在5μM的凋亡抑制率为15%左右，为下面的抗迁移和侵袭实验提供基础。在Transwell上室加入用无血清培养基重悬经药物处理过的细胞，下室加入含10%FBS的血清培养基，孵育8小时，固定，结晶紫染色，拍照统计细胞数量。如图2所示，5μM和2.5μM的LVTX-VIII孵育后，与对照组相比均有下降且具有浓度依赖性，在5μM的时候差异尤为明显。实验表明，LVTX-VIII能诱导A549和H460细胞的凋亡，同时又有很强的抑制肿瘤细胞迁移的作用。实验进一步检测了LVTX-VIII对2种癌细胞的集落形成能力。图3结果显示5μM的LVTX-VIII能够明显抑制细胞的集落形成，说明经药物处理后癌细胞在低密度下的生长能力受到了限制，低浓度的药物处理后能抑制癌细胞的增殖，高浓度下能够诱导癌细胞的凋亡,进一步说明该药物在抗肿瘤方面的潜在作用和开发价值。2.2LVTX-VIII的体内抗肿瘤增殖作用为了进一步验证在体内是否有抑制肿瘤生长的作用，我们构建了荷瘤模型，A5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种带斑狼蛛

【技术特征摘要】
1.一种带斑狼蛛Lycosavittata细胞毒活性肽在抗肿瘤药物研发中的应用，将从带斑狼蛛Lycosavittata的CDNA中设计合成一种具有强细胞毒活性的线性肽用于抗肿瘤药物研发；所述的抗癌肽是从带斑狼蛛Lycosavittata的蜘蛛CDNA文库中设计合成出来的活性多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中华，梁宋平，张鹏，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43