一种重组葡激酶的制备方法技术

一种重组葡激酶的制备方法，现有技术中重组质粒表达水平低，纯度低，而且得率也很低。本发明专利技术通过ＰＣＲ扩增葡激酶基因，与原核表达载体如ＰＬＹ－４质粒重组，形成ｐＳＴＥ－ＳＡＫ－１表达质粒，ｐＳＴＥ－ＳａＫ－１转化大肠杆菌，用温度诱导基因表达。工程菌经发酵扩增，压榨破碎细菌，用离子交换和凝胶过滤二步法从上清液纯化ｒ－Ｓａｋ，本方法得到的葡激酶产品纯度和得率都很高，成本低。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物技术方法。葡激酶(Staphylokinase，SaK)为金黄色葡萄球菌溶源性噬菌体合成的一种蛋白水解酶。自1948年Lack C.H.发现金黄色葡萄球菌合成的SaK能激活血浆蛋白酶以来，由于种种原因，如金黄色葡萄球菌合成和分泌SaK水平很低，纯化SaK时很难去除内毒素等杂质，以致SaK结构，功能及其临床应用价值的研究进展缓慢。随着重组DNA技术的发展，Sako-T等从金黄色葡萄球菌中分离到含有SaK基因的噬菌体，从噬菌体基因组中切下SaK基因及其启动子等调控序列，与PBR322载体重组，构建了含有r-SaK基因的克隆，并实现了在大肠杆菌中的表达。Behnke-D等则用酵母表达SaK基因。1993年D.Collen等用Sako.T类似方法分离SaK基因，与PUC19重组后在大肠杆菌中进行表达，表达产物存在于培液，周围膜间隙和菌体内，经离子交换、亲和层析和凝胶过滤后得纯品＜6mg/L培养物。上述各家实验室建立的基因构建和产物纯化方法复杂，产率很低。本专利技术的目的是提供一种新的制备重组葡激酶的方法。其中用PCR构建基因，基因表达水平极高，r-SK以可溶性，活性状态存在于菌体内，纯化方法简单，产物纯度高和产量高，成本低。本专利技术采用下述技术方案(1)从人体分离溶血性金黄葡萄球菌，选择纤溶性最高者大量培养，从培养液提纯葡激酶，测定其N和C端5个氨基酸顺序作设计引物的参考，以该菌株大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增葡激酶基因，与PUC19质粒载体重组后，经核苷酸顺序分析肯定基因结构。(2)r-SaK基因与原核表达质粒(如含PL，PR启动子，CIt857基因，5SRNA终止信号等调控元件的载体)重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，用温度诱导r-SaK基因的表达;表达产物r-SaK以可溶性、活性状态存在于细胞浆中，占菌体蛋白40%以上。工程菌命名PSTE-SAK-1。(3)发酵技术用低营养液基础培养PSTE-SAK-1，温度诱导前后用LB，葡萄糖，稀有元素溶液补料，发酵时温度以30-42℃合宜，DO＝50-80%，PH＝6-8，搅拌速度随DO升高而减少。(4)工程菌用高压破碎，离心后，经离子交换、凝胶过滤二步法从上清液纯化r-SaK。纯品r-SaK中加入人血清白蛋白、谷氨酸钠、磷酸盐等稳定剂后，微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成白色粉状成品。成品用注射用水溶解后供注射用，以治疗心肌梗塞，肺、脑、周围血管栓性栓塞，血液透析通路和血液中血凝块，防治介入治疗时动脉插管阻塞，显微外科吻合口血栓，以及眼内积血和渗出等疾患。基因结构和内切酶图谱见图1，图2。葡激酶分子量约为15.5KD，激活纤溶酶原(plasminogen，plg)的过程类似于链激酶，首先SaK和plg结合形成1∶1的复合物，然后该复合物激活另一分子plg，形成纤溶酶，后者催化纤维蛋白水解，溶解血栓，恢复血液循环。在血浆中，SaK和plg形成复合物SaK-plg后，如果没有纤维蛋白存在，则该复合物很快被α2-抗纤溶酶中和，然后被巨噬细胞吞噬;在有纤维蛋白存在时，SaK-plg复合物中plg分子上的赖氨酸结合位点和纤维蛋白结合，丧失了与α2-抗纤溶酶的结合位点，不受其抑制，因此不仅能高效激活血栓中plg，特异地溶解血栓，而且不易诱发系统性纤溶状态。动物溶血栓模型亦证明，SaK在溶解血栓的同时，没有引起纤维蛋白原的明显降低。此外SaK尚有以下突出优点分子量小，穿透性能好，对富含血小板的血栓，尤其是脑动脉血栓和肢体动静脉血栓的溶解作用比其他溶栓药物强，具有更好的疗效，本专利技术构建的SaK基因，用大肠杆菌高效表达r-SaK，不仅产品得率高，每升发酵液可得纯品400-500mg，而且纯度达97-99%，与D.Collen等方法每升发酵液6mg得率相比，本专利技术的效果显著提高，其成本则低廉得多。实施例(一)1、从人体鼻咽部分离60株金黄色葡萄球菌，分别接种于LB培养液中生长过夜，离心收集细菌，上清用纤维蛋白板测SaK活性，有8株能分泌SaK，其中No.4活性最高，在纤维蛋白板中用牛纤溶酶原代替人纤溶酶原作鉴别试验，证明No.4分泌的是SaK。大量培养No.4金黄色葡萄球菌，经离子交换和分子筛纯化15KD蛋白质，并用反转纤维蛋白板等方法证明此15KD蛋白具有纤溶活性，然后进行N-末端和C-末端氨基酸顺序分析，用于设计PCR引物。国外文献或专利文献报道的均从噬菌体基因组中分离Sak基因及其调控序列，本专利技术直接以金黄色葡萄球菌大分子DNA作模板通过PCR扩增和制备Sak基因。2、用PCR扩增葡激酶基因培养No.4金黄色葡萄球菌，按Frederick M.Ananbel et al方法制备菌体高分子DNA。挑单个菌落接种于LB培液(37℃过夜培养)，5000rpm离心10分钟，取菌块悬于缓冲液，加SDS和Proteinse K后，50℃保温4小时。用等体积氯仿/异戊醇抽提，再离心分层，上层液再用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，上层液加入0.6 Vol异丙醇。离心沉淀，用75%酒精洗涤两次，抽干后溶于TE缓冲液，紫外分光检测证明A260/A280大于2.0。N、C末端氨基酸顺序测定结果设计PCR引物，并用固相磷酸三酯法藉DNA合成仪合成，纯化后用于扩增葡激酶基因。两个PCR引物的5’末端分别含有限制性内切酶识别位点。PCR反应总体积100μl，含模板DNA 0.5μg引物Ⅰ 50.0pmoles引物Ⅱ 50.0pmolesdNTP 2.0mmol/L10×PCR缓冲液ddH2OTaq DNA聚合酶 2.5UPCR反应时92℃变性90秒，70℃延伸60秒，52℃退火60秒。15个循环后再加2.5UTaqDNA聚合酶，再进行15个循环，反应结束后取2μl作琼脂糖凝胶电泳，用紫外灯检测，在400～500bp之间出现一条十分明亮的条带，其中所含核酸片段的长度符合完整葡激酶基因长度。3、葡激酶基因克隆的构建和鉴定PCR产物用限制性内切酶水解后，加入经相应的酶完全水解后的PUC19质粒载体和T4DNA连接酶反应体系，室温放置1小时后，转化大肠杆菌JM83，用氨苄青霉素-LB平板在37℃温箱中筛选培养。挑取单个菌落按Sambrook方法制备质粒，用酶切鉴定，呈现特征性条带者命名pST-Sak-1。质粒pST-SaK-1经核苷酸顺序分析证明pST-SaK-1质粒中SaK基因的核苷酸顺序和阅读框架。4、葡激酶基因克隆在大肠杆菌中的表达表达质粒的构建-pST-SaK质粒经双酶解后，用琼脂糖凝胶电泳分离，回收400～500bpSaK基因，并与原核表达载体如pLY-4(含PL，PR启动子，CIt857基因，55RNA终止信号等调控元件)重组，反应物转化大肠杆菌K802，用氨苄青霉素-LB平板筛选培养。挑取单个菌落，制备质粒，用酶解鉴定，含SaK基因特征性片段者，称表达质粒为pSTE-SaK-1，工程菌为PSTE-SAK-1。葡激酶基因诱导表达和表达产物的鉴定-挑取PSTE-SaK单个菌落，在LB培液中30℃振荡培养过夜，次日用低营养培液按1∶100稀释后，在摇瓶中30℃培养至A600～0.6(约4～5小时)，然后进行诱导培养3小时，5000r.p.m.离心收集细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组葡激酶的制备方法，包括葡激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达，以及工程菌的发酵，和表达产物的分离、纯化等，其特征在于：（１）从人体分离溶血性金黄色葡萄球菌，选择纤溶活性最高者大量培养，从培养液提纯葡激酶，测定其Ｎ和Ｃ端５个氨基酸顺序作设计引物的参考，以该菌株大分子ＤＮＡ作模板，通过ＰＣＲ直接扩增葡激酶基团，与质粒载体重组合，比核苷酸顺序分析基因结构；（２）ｒ－ＳａＫ基因与原核表达载体，含ＰＬ、ＰＲ启动子、ＣＩｔ８５７基因、５ＳＲＮＡ终止信号等调控元件的ＰＬＹ－４质粒重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，用温度诱导ｒ－ＳａＫ基因的表达；表达产物ｒ－ＳａＫ以可溶性、活性状态存在于细胞浆中；占菌体总蛋白４０％以上。（３）发酵技术：用低营养基础培养工程菌，温度诱导前后用ＬＢ，葡萄糖，稀有元素溶液补料，发酵时温度为３０－４２℃，ＤＯ＝５０－８０％，ＰＨ＝６－８，搅拌速度随ＤＯ升高而减少；（４）工程菌用压榨破碎，离心后，经离子交换、凝胶过滤二步法从上清液纯化ｒ－ＳａＫ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋后燕，
申请(专利权)人：上海医科大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]