高分子量的脱硫水蛭素制造技术

一种由具有水蛭素活性的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的２－４个残基组成的轭合物，其中该轭合物是非融合蛋白，并且具有水蛭素活性的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的残基不是通过戊二醛或碳化二亚胺连接的。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及凝血酶抑制剂领域，并描述了借助遗传工程手段生产改性的水蛭素，具体指脱硫水蛭素(desulphatohirudin)突变蛋白的方法。本专利技术的另一目的是提供通过将所述水蛭素的2到4个单体结合起来，从而制备具生物活性的高分子量水蛭素的方法。水蛭素是水蛭(如医学上用的水蛭医用水蛭)中天然产生的抗凝血剂。水蛭素等于是在N-末端富集疏水氨基酸并在C-末端富集极性氨基酸且含有三个二硫键并通常有抗凝活性的正起作用的多肽。大多数天然水蛭素的一个特征是在其分子的C-末端(Tyr63)有一个硫酸酪氨酸酯残基。除去已知的水蛭素变异体HV1、HV2和HV3外，已报道实际上还存在其它水蛭素(参见，如M.Scharf et al.，FEBS Lett.255，105-110(1989))，从而支持了水蛭素作为一个同效抑制剂族的概念。水蛭素，如水蛭素变异体1(HV1)，是凝血酶即丝氨酸蛋白酶的最有效并最了解的抑制剂，所述丝氨酸蛋白酶催化血液凝集作用的最后步骤(将酶原纤维蛋白原转化成可凝固的纤维蛋白)。水蛭素并不抑制血液凝固级联反应中的其它酶。与在传统抗凝治疗优选的抗凝剂即肝素相反，水蛭素直接对凝血酶发挥其抑制作用，且与前者不同，并不是通过抗凝血酶Ⅲ起作用。纯化水蛭素唯一的药物学可检测效果是抑制血液凝固并预防血栓形成。给狗静脉内施用水蛭素后，甚至以高剂量下也未观察到副作用，如对心率、呼吸、血压、血小板数量、纤维蛋白原和血红蛋白的影响。在一系列的动物模型中，已证明水蛭素在实验性血栓形成(由停滞或由注射凝血酶引起的)，内毒素性休克以及DIC(弥散性血管内凝血)中的有效性。从已完成的直接对比试验看，已证明水蛭素优于肝素。近年来，已经在微生物宿主如大肠杆菌，特别是啤酒酵母中，克隆并表达了编码水蛭素变异体的cDNA和合成基因。尽管这种表达产物在Tyr63没有硫酸盐单酯基团-并因此而称之为“脱硫水蛭素”一但结果它们表现出与天然硫酸化水蛭素基本相同的生物活性。重组脱硫水蛭素的一种治疗用特性是其在循环中的半衰期为约50分钟，并因此会迅速从人体内排出。迅速排泄的原因是肾脏肾小球对于分子量低于70000的物质的过滤作用。由于这种迅速的排泄，脱硫水蛭素日剂量一般分成两次或更多次施用。为得到更长效凝血酶抑制剂的一种办法是合成高分子量的水蛭素。在WO 91/08229中描述了水蛭素与聚二醇的轭合作用。由于聚二醇在分子大小和重量方面一般很不均一，因此，其与水蛭素的结合会产生不均一的混合物并且不容易施用规定剂量的水蛭素。在另一种方法中，将水蛭素与其它蛋白质如白蛋白交联(WO 92/05748)。这些轭合物表现出活性降低并且致免疫特性提高，因此不适于长期施用。在WO 91/09125中，描述了相对失活的融合蛋白，它们由凝固级联反应的酶激活，从而具有纤维蛋白溶解或凝块形成抑制活性。令人吃惊的是，已经发现，由脱硫水蛭素突变蛋白或脱硫水蛭素衍生物的二到四个残基组成的轭合物具有显著提高的血浆半衰期，即使其分子量低于约70，000的临界值(见上文)，所述轭合物还令人惊异地末表现出有可检测的提高的致免疫特性，没有被与血液凝固有关的酶裂解并且活性末发生改变。由于血浆半衰期的提高，就有可能一次施用每日剂量的脱硫水蛭素。本专利技术涉及一种实质上由脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的两至四个残基组成的轭合物，其中所述轭合物不是融合蛋白，而且具有水蛭素活性的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的残基不是经戊二醛或碳化二亚胺相连的。术语“脱硫水蛭素”包括文献中描述或由转化的微生物菌株得到的所有脱硫水蛭素化合物，所述微生物菌株含有编码脱硫水蛭素或其衍生物的DNA。上述脱硫水蛭素是例如脱硫水蛭素衍生物HV1、HV2和HV3(PA)，以及M.Scharf等人(FEBS Lett.(1989)，255，105-110)和EP-A-347376描述的其他水蛭素以及hirullin蛋白。应理解具有水蛭素活性(即具有凝血酶抑制作用和/或凝血酶结合作用)的水蛭素衍生物或较短的片段也包括在术语“脱硫水蛭素”的范围内。上述片段和衍生物是例如C-末端截短的脱硫水蛭素，即在C-末端缺少最多达7个氨基酸的脱硫水蛭素。可以通过连接其它反应性基团来修饰脱硫水蛭素或其活性片段或衍生物，其中，反应性基团对凝血酶活性有生物学影响。例如，可以将位于C-末端的脱硫水蛭素的凝血酶结合区与化学合成的凝血酶抑制剂结合。上述化学修饰的脱硫水蛭素衍生物的实例是水蛭素类似物(hirulogs)(WO 90/04642)。在优选的实施方案中，本专利技术的轭合物实质上由脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的两个残基组成。本专利技术所述轭合物的组分，即脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的残基，可以是相同或不同的。脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物直接或经连接基团相连。为了达到该目的，通常脱硫水蛭素的一个或多个(优选的是一个)天然氨基酸被一个或多个能交联的基团(如带有反应性侧链的氨基酸)替代。本专利技术的目的之一是提供能形成轭合物的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物，轭合物实质上由所述脱硫水蛭素的两到四个残基组成。在本专利技术优选的实施方案中，由选自Asp、Glu、Lys和Cys的氨基酸替代脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的一个或多个天然氨基酸。替代一个氨基酸是优选的，更优选的是由Cys替代一个氨基酸，最佳为由Cys替代脱硫水蛭素HV1中的Asp33可以通过在一个残基的Asp或Glu与另一残基中的Lys之间形成肽键，或优选的在两个Gys残基之间形成二硫键来生产由两个脱硫水蛭素残基组成的轭合物。在另一方法中，也可以经连接基团连接本专利技术轭合物的组分(脱硫水蛭素突变蛋白或脱硫水蛭素衍生物的两到四个残基)。在这方面，通过反应性侧链例如上述定义的导入氨基酸的反应性侧链，将脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物与有两个或更多反应性基团(两个反应性基团是优选的)的连接分子相连，所述反应性基团可与脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的反应性侧链反应并形成共价键。所述连接分子是带两个或更多反应性基团例如-SH、-N3、-COOH、-COBr、-COCl、-NH2、-CHO、-CO-O-CO-、-CO-NH-CO-的分子。实例是N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺、对-叠氮基吩嗪基溴、对-叠氮基苯基乙二醛、N-4-(叠氮基苯基硫代)苯邻二甲酰亚胺、二(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(suberate)、二(丁烯二酰亚氨基)已烷、二砜、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸芪、己二亚胺酸二甲酯、庚二亚胺酸二甲酯、辛二亚胺酸二甲酯、二硫代二(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基酒石酸酯、3′，3′-二硫代二丙亚胺酸二甲酯、4，4′-二硫代二叠氮基苯、3，3′-二硫代二(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、乙基-4-叠氮基-1，4-二硫代丁亚胺酸酯、1-叠氮基-4-氟-3-硝基苯、N-羟琥珀酰亚氨基-4-叠氮基苯甲酸酯、甲基-4-叠氮基苯甲亚胺酸酯、间-顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟磺基-琥珀酰亚胺酯、N-羟琥珀酰亚氨基-4-叠氮基水杨酸、对-硝基苯基-2-重氮基-3，3，3-三氟丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1，3′-二硫代丙酸酯、磺基琥珀酰亚胺基2-(间-叠氮基-邻硝基苯甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：H·格罗森巴赫，J·Y·张，W·马基，
申请(专利权)人：诺瓦蒂斯有限公司，UCP珍制药公开股份有限公司，
类型：发明
国别省市：