细菌素制造技术

本发明专利技术涉及易变微球菌细菌素、产生所述细菌素的菌株，尤其是菌株ＣＮＣＭ Ｉ－１５８６和ＣＮＣＭ Ｉ－１５８７以及制备该细菌素的方法和该细菌素在制备食品和化妆品中作为抗病原菌活性剂的应用。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌素、产生所述细菌素的菌株、制备所述细菌素的方法以及所述细菌素和/或产生所述细菌素之菌株在生产食品和化妆品中的应用。细菌素已从许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中分离出。细菌素是一类其本质为蛋白质而且具有杀菌作用的分子，正因为此，它能够在其产生菌与一种或多种不同的细菌之间引起拮抗反应。而且，细菌素的抑菌谱通常局限于与产生细菌素菌种非常相关的菌种。确切地说，细菌素已在乳酸菌中得以证实。例如，EP0643136(Societe des produits Nestle)描述了从嗜热链球菌中鉴定的两种细菌素。类似地，从乳酸乳球菌中也已分离到一种细菌素(App.and Env.Microbio.58，279-284，1992；J.of Bio.Chem.268，16361-16368，1993)。然而，至今尚不了解得自易变微球菌中的细菌素。易变微球菌目前被大量地用于食品领域。尤其是用于鲜肉的发酵以制备如意大利香肠和腊肠的熟食制品。因此，易变微球菌将在获得可抵抗致病因子的产细菌素菌株方面非常有用。本专利技术的目的就是针对这一需要而提出的。为此，本专利技术的细菌素即为易变微球菌细菌素，其具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者是通过1-4个氨基酸的一次取代，缺失和/或插入而不同于序列SEQ ID NO1的任何氨基酸序列。而且，任何编码该细菌素的核苷酸片段，尤其是具有序列SEQ ID NO2的核苷酸片段也在本专利技术的范围内。类似地，本专利技术的菌株为产生该细菌素的易变微球菌，尤其是易变微球菌菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587。在制备本专利技术细菌素的方法中，在适于菌株生长的培养基和生长条件下培养产所述细菌素的易变微球菌菌株，特别是菌株CNCM I-1586或菌株CNCMI-1587，以得到含107-1011生物体/ml的培养物培养基，然后将所得培养物离心，制备含细菌素的上清液提取物。最后，本专利技术易变微球菌细菌素的用途包括将其核苷酸序列及其信号序列、含细菌素的上清液提取物和产所述细菌素的易变微球菌菌株用于制备食品和化妆品。本专利技术的细菌素在下文中将被称为“易变素”(Variacin)。在本专利技术中，任意单位(arbitrary Unit au)被定义为样品在技术人员已知的“琼脂孔试验”中仍然表现出杀菌作用时的最大稀释值的反比。在本专利技术中，术语“片段”或“DNA片段”应理解为作为部分或完整编码并能被合成，通过例如已知的聚合酶链反应方法在体外进行复制或在例如E.coli中进行体内复制的单链或双链DNA片段。在本专利技术中，“同源片段”被理解为通过小量碱基的取代、缺失或插入而仅仅不同于本专利技术片段的任何片段。在说明书中，两个由于遗传密码简并性而编码一个和相同多肽的DNA片段尤其应该被认为是同源的。与本专利技术的片段有80％以上同源性的片段也将认为是同源片段。在后一种情况下，同源性由同源片段中的碱基数与本专利技术片段中的碱基数之比确定。最后，本专利技术含义中的“杂交片段”应理解为能够与本专利技术的片段经Southern印迹法杂交(Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，1989，Chapter 9.31-9.58)的任何片段。优选地，在苛刻或严格条件下进行杂交，以避免非特异性杂交或相对不稳定的杂交。我们已从菌株CNCM-I-1586和CNCM I-1587分离出一种蛋白质性因子，即具有强力杀菌作用的细菌素。该细菌素得自易变微球菌，并显示为下文所描述的氨基酸序列SEQ ID NO1，它已被命名为易变素。根据易变素所提供的意义，本专利技术还涉及具有不同于SEQ ID NO1之氨基酸序列的任何细菌素，所述的差别是由于1-4个氨基酸的一次取代，缺失和/或插入造成的。因此，上述具有因1-4个氨基酸的一次取代，缺失和/或插入而不同于序列SEQ ID NO1之氨基酸序列的细菌素可以比例如所述易变素有更广的细菌属或细菌种的抑菌谱。还有可能选择编码得自两个菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587之本专利技术易变素的染色体核苷酸片段。所述片段显示为下文所给出的序列SEQ ID NO2。根据本专利技术所提供的意义，本专利技术还涉及编码本专利技术易变素的任何核苷酸片段，尤其是与序列SEQ ID NO2同源或与之杂交的核苷酸片段。更确切地说，本专利技术涉及编码所述易变素信号肽的序列SEQ ID NO2之核苷酸88-153、编码本专利技术被分泌易变素的序列SEQ ID NO2之核苷酸154-228和/或编码与其信号肽融合之所述细菌素的序列SEQ ID NO2之核苷酸88-228。编码所述被分泌易变素的片段可以有利地用于在植物或在除了易变微球菌之外的微生物中表达专利技术的易变素。为此，将序列SEQ ID NO2之核苷酸154-228克隆到表达载体启动子或信号序列的下游，终止子的上游，对阅读框给予应有的注意时，再将所述载体导入植物、细菌或酵母中，以便拓宽其针对例如某些细菌的抑菌谱。对本专利技术的信号序列加以应用是通过将序列SEQ ID NO2之核苷酸88-153与目的基因融合，对阅读框给予应有的注意时，再通过将整个融合体克隆到易变微球菌表达载体，以使由所述目的基因编码的蛋白质在例如易变微球菌中表达和分泌。序列SEQ ID NO2之核苷酸88-228能够被克隆到易变微球菌表达载体，并再导入另外的易变微球菌菌株，以使后者产生本专利技术的易变素。此外，通过整合入其基因组或借助表达载体而含有编码本专利技术易变素之DNA片段的易变微球菌也是本专利技术主题的一部分。更确切地说，根据布达佩斯条约的规定，已于1995年6月7日在国立微生物培养物保藏中心保藏(INSTITUT PASTEUR，25 Rue du Docteur Roux，F-75724 PARIS CEDEX1.5France)、保藏号为CNCM I-1586和CNCM I-1587的易变微球菌菌株是本专利技术主题的一部分。易变微球菌为G+、过氧化氢酶阳性的永久静止性需氧菌。其形态为球状，以无规则排列的四分体形式存在。易变微球菌菌落在BHI培养基上呈黄色，其最适生长温度为25-37℃。作为本专利技术之主题部分的菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587可以代谢葡萄糖和果糖，CNCM I-1587菌另外还代谢蔗糖和呋喃糖。此外，菌株CNCM I-1586携带4kb和12kb的两个质粒，而菌株CNCM I-1587仅携带一个7kb质粒。菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587的培养物上清液相对其它细菌的生长显示出了较广的抑制谱。下列细菌是举例说明对所述上清液敏感之细菌乳酸乳球菌、瑞士乳芽胞杆菌、德彼利代乳芽胞杆菌保加利亚亚种、德彼利氏乳芽胞杆菌乳酸亚种、德彼利氏乳芽胞杆菌德彼利氏亚种、嗜酸乳芽胞杆菌、约翰逊氏乳芽胞杆菌、植物乳芽胞杆菌、清酒乳芽胞杆菌、弯曲乳芽胞杆菌、Leuconostoc carnosum、肠系膜状明串珠菌肠系膜状亚种、嗜热链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪肠球菌粪亚种、枯草芽胞杆菌的孢子和无性细胞、蜡状芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、短小芽胞杆菌和液化形芽本文档来自技高网...

【技术保护点】
得自易变微球菌的细菌素，其特征在于它具有氨基酸序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ∶１。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B莫列特，J皮尔，D普里莫尔，N列基夫，B苏里，
申请(专利权)人：雀巢制品公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]