非自动失活的定位表达的逆转录病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及能进行启动子转变的逆转录病毒载体，它包括结构Ｕ３－Ｒ－Ｕ５的一个５′ＬＴＲ片段；一个或几个选自编码和非编码序列的序列；以及包括全部或部分缺失的Ｕ３片段的３′ＬＴＲ片段，其中，所述缺失的Ｕ３片段被一个多接头序列取代，其后是Ｒ和Ｕ５片段。所述逆转录病毒载体能进行启动子转变，并可用作定位基因治疗的基因转移载体。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体包括能进行启动子转变的载体(ProCon载体)。该载体系统能被用作定位基因治疗的基因转移载体。将逆转录病毒载体用于基因治疗业已得到许多关注，而且，目前已成为在美国和欧洲得到批准的多种方案中可选的转移治疗基因的方法(Kotani等，1994)。然而，上述方案大多要求在体外用带有治疗基因的逆转录病毒载体转染靶细胞，随后再把感染成功的细胞送回损伤了的个体内(Rosenberg等，1992；关于综述，参见Anderson，1992)。这种来自体内的基因的治疗方案适于治疗医学疾病，其中，所述靶细胞群易被分离(例如淋巴细胞)。另外，这种来自体内的靶细胞的感染使得可以给药大量的浓缩了的病毒，而且该病毒在使用之前可作严格的安全试验。遗憾的是，仅有一部分可用于基因治疗的靶细胞易被分离、培养，然后再被导入。此外，来自体内的基因的治疗所需的复杂技术及相应的高花费，事实上妨碍了其在世界范围内的广泛应用。未来的简便省钱的基因治疗将要求一种体内途径，在该途径中，以注射病毒载体或产生病毒载体的细胞或简单植入能产生逆转录病毒的细胞的形式直接对患者给药。当然，这种体内途径会引起种种新问题。首先而且最重要的是，必须强调考虑到安全性。由于植入了能产生病毒的细胞而可能产生病毒，而且没有机会预先检验所产生的病毒。明白有关使用该系统所会遇到的一定危险，以及争取生产出能减少这种危险的新系统是重要的。逆转录病毒载体系统由两个部分组成(附图说明图1)1)该逆转录病毒载体本身是一种被修饰了的逆转录病毒(载体质粒)，其中，编码病毒蛋白的基因已被有待转移到靶细胞里的治疗基因和标记基因所取代。由于编码病毒蛋白的基因被取代有效地破坏了该病毒，必需由该系统中的第二个部分对其进行拯救，该部分能提供上述被修饰了的逆转录病毒所缺少的病毒蛋白。所述第二个部分是2)能产生大量病毒蛋白，但缺乏产生可复制病毒能力的细胞系。该细胞系被称为包装细胞系，它由被另一种质粒转染的细胞系组成，该质粒带有使所述被修饰了的逆转录病毒载体能被包装的基因。为了产生所述包装了的载体，将该载体质粒转染到所述包装细胞系中，在这些条件下，所述被修饰了的逆转录基因组(包括插入的治疗基因和标记基因)由所述载体质粒转录，并被包装到被修饰了的逆转录病毒颗粒(重组病毒颗粒)中。然后，用这种重组病毒感染靶细胞，在此过程中，载体基因组和所携带的任何标记或治疗基因被整合到该靶细胞的DNA中。由这种重组病毒颗粒感染的细胞不能产生新的载体病毒，因为在这样的细胞中没有病毒蛋白。然而，带有治疗及标记基因的载体DNA被整合到细胞DNA上，并可以在被感染的细胞中表达。由于原病毒形式的逆转录病毒基因组实际上是以随机形式整合到受感染细胞的基因组中(Varmus，1988)，根据其插入激活可以鉴定若干细胞原癌基因(Varmus，1988；Van Lohuizen和Berns，1990)。由于类似机理可能会导致接受带有被用于治疗其它已存在的医学疾病的治疗基因的逆转录载体治疗的患者长癌，已产生一再发生的伦理问题。大多数研究人员会同意，复制缺陷逆转录病毒载体，例如复制所有目前使用的整合至或靠近与有关控制细胞增殖的细胞基因的载体的可能性小到趋近于零。不过，通常还是承认，由单一的感染事件所引发的可复制逆转录病毒的极为迅速地发展会最终产生，足以使得这种表型整合变成极为真实的可能的整合事件。对逆转录病毒系统进行优化，以减少出现可复制病毒的机会。不过，已有许多文献证明，所述逆转录病毒载体系统的组份之间的重组，会导致潜在致病性可复制病毒的产生，业已构建了若干代载体系统，以减少这种重组的危险(见Salmons和Günzburg的综述，1993)。从安全角度和纯实践角度来看，在考虑采用体内基因治疗时的另一个考虑因素是逆转录病毒载体的定位。很清楚，由载体所携带的治疗基因不应该在所有组织和细胞中不加选择地表达，而只能在要求的靶细胞中表达。如果待转移的基因是用于切除特定肿瘤细胞的毒素基因的话，这一点尤为重要。很显然，切除其它非靶细胞是很不合在此之前，业已披露了若干会使所携带的治疗基因定位的逆转录病毒载体系统(Salmons和Gunzburg，1993)。这些方法中的大部分涉及将感染行为局限于预定细胞类型，或是用异源启动子指导转入特定类型细胞中的连锁的治疗基因或标记基因的表达。所用的异源启动子应当只能在这种类型的细胞中启动连锁基因的表达这种启动子在所述细胞中是有正常活性的。所述启动子已早先同标记基因或治疗基因一起被插入到所述逆转录病毒载体上的gag、pol或env基因位点上。在所述基因旁侧的逆转录病毒长末端重复序列(LTR)带有逆转录病毒启动子，该启动子通常是非特异性的，它可以启动在许多不同类型细胞中的表达(Majors，1990)。有人报道过LTR启动子与异源内部启动子如在上文中所述的组织专一性启动子之间的启动子干扰。另外，业已知道逆转录病毒LTRs具有强增强子，它们可以独立地或是与逆转录病毒启动子一起干扰靠近该逆转录病毒的整合位点的细胞基因的表达。其机理已被证实为是因动物的致癌性所致(Van Lohuizen和Berns)。以上两个发现促进了自动失活载体(SIN)的发展，其中，逆转录病毒启动子在靶细胞内是功能性失活的(PCT/WO94/29437)。对所述载体的进一步修饰包括将启动子基因盒插入LTR片段，以产生双拷贝载体(PCT/WO89/11539)。不过，在这两种载体中，插入到载体主体上的或插入到LTR片段上的异源启动子直接同标记/治疗基因连接。上文提及的早先所披露的带有缺失的3′LTR的SIN载体(PCT/WO94/29437)还使用了一个强异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子，由它代替逆转录病毒5′LTR启动子(无U3 5′LTR)启动所述载体结构在包装细胞系中的表达。在3′LTR中还有一个异源聚腺苷酸化信号(PCT/WO94/29437)。本专利技术的目的是要构建一个新的逆转录病毒载体，可将其用作定位基因治疗的安全的基因转移载体，它与包装结构发生重组的可能性较少。这种新载体在3′LTR上带有异源启动子和/或调节因子，在感染之后，该启动子和/或调节因子被复制并易位至靶细胞的5′LTR，最终控制标记/治疗基因的表达，这些基因并不直接同启动子连接，而是插入载体的主体上。这种载体不能进行自动失活，而能进行启动子交换，给启动子转变(Promoter Conversion)取名为Procon。由于启动子转变不会导致自动失活，因此，逆转录病毒载体在靶细胞内具有转录活性。不过，两个LTRs会在靶细胞内构成一个大的异源启动子/增强子序列。这样可以减少整合在靶细胞中的载体经过较长时间后发生失活的可能性，这种失活与已报导过常规载体的失活现象(Xu等，1989)相同；还可以减少与内源逆转录病毒序列发生重组的可能性，而这种重组会产生潜在的致病性可复制病毒，因而提高了该系统的安全性。在本专利技术中，未对逆转录病毒载体结构的5′LTR进行修饰，该病毒载体在包装细胞中的表达由正常的逆转录病毒U3启动子启动。可以进行正常的逆转录病毒聚腺苷酸化，而且在3′LTR中没有异源聚腺苷酸化信号。这对于体内基因治疗方法的改进来说是重要的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能进行启动子转变的逆转录病毒载体，该病毒载体包括结构Ｕ３－Ｒ－Ｕ５的一个５′ＬＴＲ片段；一个或几个选自编码和非编码序列的序列；以及 一个包括全部或部分缺失的Ｕ３片段的３′ＬＴＲ片段，其中，所述缺失的Ｕ３片段由多接头序列取代，随后是Ｒ和Ｕ５片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：沃尔特H冈兹伯格，罗伯特M萨勒，
申请(专利权)人：GSF环境与健康研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]