具有增强稳定性和生物活性的酸性成纤维细胞增长因子类似物制造技术

本发明专利技术提供了ＦＧＦ家族的蛋白质类似物。这些类似物比相应的天然存在的蛋白质更加稳定。增强的稳定性是通过在蛋白质氨基酸序列的一个已鉴定为环形成区域，用至少一个具有较高环形成潜能的氨基酸替代一个具有较低环形成势能的氨基酸来获得的。本发明专利技术的类似物特别适用于治疗。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
有时被称为软组织生长因子的许多蛋白质因子可介导组织损伤如创伤或烧伤之后的复杂的愈合过程，新细胞生长和分化需要这些因子用于替代损伤的组织。这类软组织生长因子包括一个成纤维细胞生长因子(FGFs)的蛋白质家族。对于各种上皮、间质、神经起源的细胞FGFs是促有丝分裂和趋药性的。另外，FGFs是促血管形成的，即他们能刺激血管的形成。FGFs家族的成员包括酸性FGF，碱性FGF、KGF、Int-2、HST、FGF-S和FGF。酸性FGF(aFGF)和碱性FGF(bFGF)被认为是FGF家族的两个“原始”成员。已经确定aFGF和bFGF起源于同一祖先基因，除具有相同的内含子/外显子结构外，两个分子具有大约55％的序列等同性。尽管不排除存在特殊的aFGF和bFGF受体，但是酸性FGF和bFGF结合于同样受体也是已知的。在不同组织中发现了几种分子量形式的aFGF和bFGF。然而，Southern印迹试验表明对于aFGF和bFGF各自只有一个基因，这些分子之间的差别可能是由于翻译后的加工造成的。在体外和体内，对于许多种类的中胚层和神经外胚层起源的细胞类型酸性和碱性FGF是分裂素，并能诱导血管形成(参见，例如Gospodarowicz等(1979))，Exp.Eye.Res，28501-514。尽管在大多数生物测试系统中bFGF比aFGF大约有高出十倍的效力，这两类的生物学活性的范围接近相同。对于多种细胞KGF显示了强有力的促有丝分裂活性并且它结合于aFGF和bFGF也可能结合的Balb/mk角蛋白细胞上的细胞表面受体(Bottaro et al(1990)，J.Biol.Chem.26512767-12770)，但是，KGF与已知的FGFs(即aFGF和bFGF)的区别在于它对于成纤维细胞或内皮细胞不能促有丝分裂。Rubin et al.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86802-806。在NIH/3T3成纤维细胞上还有不同于aFGF和bFGF受体的KGF受体该受体不能与KGF相互作用。Bottaro et al.。aFGF和bFGF的一个共同的明显的特性是这些因子与肝素紧密结合的趋势。aFGF具有一个阴离子等电点，它表现出来的与肝素的亲和力比bFGF弱(Thomas et al(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA826409-6413)。aFGF和bFGF的这一独特的肝素结合特性大大有利于这些因子的纯化。FGFs对固定化的肝素具有强亲和力这一发现鼓舞了对FGFs体内生物学上类肝素分子的调节作用的研究。尽管肝素的整个功能范围还没有确定，肝素可以以几种方式调节FGF功能是已知的(Lobb(1988)，Eur.J.Chin Invest.，18321-326)，例如，类肝素分子在FGF功能上能起一个直接作用，包括aFGFs的激活和增效作用(Uhllrich等(1986)，Biochem Biophys.Res.Comm.，1371205-1213)。但是，在FGF对固定化肝素的亲和性它被可溶性肝素增效的能力之间没有直接的相互作用。在这一点上，肝素的增效作用力似乎是有选择地针对aFGF的。例如Uhllrich et al(1986)，同上，发现纯aFGF的增效作用程度大约是纯bFGF的十倍，把aFGF的增效力提高到大约与bFGF同样的水平。但是在存在胎儿小牛血清时，发现肝素的增效作用效果明显下降(Uhllrich et al.，sbs(1986)，同上)。据信利用FGF蛋白能有效促进属于外伤的组织的愈合。FGFs的独特的促血管形成特性使这些因子在深度创伤的治疗上特别有价值。bFGFs天然蛋白质曾经被断言对治疗心肌梗塞有用(美国专利号4,296,100和4,378,347)。另外，已经发现人bFGF能提高胎鼠海马神经元中的神经元存活力和轴突的伸展，这表明这些因子同时也可能对治疗衰退的神经紊乱，如Alzheimer’s疾病和Parkinson’s疾病有用(Wallicke etal，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833012-3016)。在治疗应用上，aFGF的有效应用的一个主要障碍物似乎与它与bFGF相比明显低的生物学活性有关。虽然用肝素研究表明所观察到的aFGF和bFGF之间效力上的差异可以通过利用肝素提高aFGF的活性到一个可与bFGF相当的水平来消除。但是药学制备上肝素的利用并不总是令人满意的。在这点上，重要的是要注意肝素是一个异源结构的高度硫酸盐化的葡糖胺聚糖，是已知为通过加快抗凝血酶III失活内环境稳定的蛋白酶的速度而起作用的抗凝血剂(Jacques(1980)，Pharmacol Rev.3199-166)。还不知道在治疗深度创伤的药物制备中利用肝素是否有害，其中某些程度的凝结可能是获得适当愈合所需要的。另外，可以实际地考虑把肝素掺入治疗创伤的药物制剂中。药物释放事项包括控制进入病人机体的药物制剂的组成(含有aFGF和肝素的组合物)，此外，胎儿小牛血清在肝素对aFGF的增效作用的负影响(Uhllrich et al观察到)表明任何通过把肝素包括在药物制剂中作为aFGF的激活或增效因子获得的优点，一旦与病人自己的血清接触后可以完全无效或丧失。本专利技术的一个目的是提供一种与天然存在的蛋白质形式相比具有增强的稳定性的来自FGF家族的蛋白质类似物。本专利技术的另一目的是在缺乏肝素时提供一个具有增强的稳定性和生物活性的aFGF的类似物。本专利技术的另一目的是提供用于治疗的aFGF类似物。专利技术概述本专利技术在FGF家族中提供新的蛋白质类似物。一种这样的类似物是一个在缺乏肝素时比天然存在的aFGF更加稳定并具有更高生物活性的aFGF类似物。另一种这样的类似物是与天然存在的KGF相比具有增强的热稳定性的KGF类似物。增强的稳定性是通过在天然存在的蛋白质的环形成序列Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr中或其周围至少用一个较高环形成潜能的氨基酸替代一个较低环形成潜能的氨基酸残基来获得的。在aFGF情况下，这个环形成序列存在于大约氨基酸92到96的区域内。在KGF的情况下，这个环形成区存在于大约氨基酸115-119的区域内。本专利技术的一个优选类似物包括将一个具有高环形成潜能的氨基酸对环形成序列中组氨酸残基进行取代。附图的简要说明附附图说明图1显示重组牛〔Ala47，Gly93〕的aFGF的核酸和氨基酸序列。附图2显示重组人〔Gly93〕的aFGF的氨基酸序列。附图3显示利用疏水作用层析的牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的洗脱曲线。附图4A和4B 显示了牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的圆二色性光谱。附图5 显示了在酰胺I′(C＝O在次生蛋白质中伸展(strech)区中牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的第二衍生物FTIR光谱。附图6显示牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物和人〔Ser70，Ser88〕bFGF浓度的对数值相对最大刺激百分数的曲线。附图7图解显示与人〔Ser70，Ser88〕bFGF相比，在缺少肝素时牛〔Ala47〕和〔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＦＧＦ家族中天然存在蛋白质的类似物，其中在所说的天然存在的蛋白质中的环形成序列－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－中的至少一个氨基酸被一个具有更高环形成潜能的不同的氨基酸残基替代。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：荒川力，GM福斯，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]