30到40度酒酒精度简便快速测定方法技术

酒精度是酒类产品的必测指标，目前缺乏兼具准确可靠、简便快速和经济实用的酒精度测定方法。本发明专利技术利用DNA片段在含乙醇体系中会发生解链导致其在260nm波长下吸光度发生改变，从而建立了一种新的酒精度测定方法。本发明专利技术针对30到40度酒筛选到合适的短双链DNA片段混合体系如SEQ ID NO：1‑2所示，建立了其吸光度x和酒样酒精度y的标准曲线方程为y=9.0744x+28.527（30≤y≤40）。本发明专利技术的酒精度测定方法适用于30到40度酒的测定，具有良好的准确性和可靠性，无需蒸馏比较安全，操作简便迅速，所需酒样量很少，且价格低廉，适合于酒厂30到40度酒酒精度测定实践。

【技术实现步骤摘要】
30到40度酒酒精度简便快速测定方法
本专利技术涉及乙醇检测方法，特别涉及一种30到40度酒的乙醇含量即酒精度的简便快速测定方法。
技术介绍
乙醇是酒的主要成分，其含量是酒品质的重要指标之一，国标中称之为酒精度，通常它是指在20℃下，每100ml酒液中含有的乙醇毫升数。酒精度是酒类产品的必测指标，目前测定方法有很多，常见的包括酒精度计法、密度瓶法、气相色谱法和近红外光谱法等。气相色谱法和近红外光谱法这两种是基于现代分析技术的方法，具有检测灵敏度高、结果精确、可以高通量测定等优点，但是也存在设备昂贵、操作复杂和检测成本高等不足，因此不适合酒厂检测实际。酒厂中最常用的是酒精度计法和密度瓶法，然而这两种方法检测前均需对饮料酒预先蒸馏，除去杂质后，再对酒精水溶液进行测定。整个检测过程耗时长、步骤多、稳定性差，不能满足快速检测发展的需求。综上可知，目前亟需建立准确可靠、简便快速且经济实用的酒精度测定方法，针对30到40度酒本专利技术提供了基于特定超短DNA片段（即寡聚脱氧核苷酸链）在不同酒精度酒样中变性程度不同导致260nm波长下吸光度有所差异，而建立了一种新的酒精度测定方法即满足此需求。DNA双链是靠碱基之间的氢键和堆积力维持的，然而在一些外在因素如高温、极端pH、有机试剂如尿素、甲酰胺、甲醇和乙醇存在时，这些维持力会遭到破坏，从而使得DNA双链解链变成单链，导致其在260nm下的吸光度大幅增加（又称增色效应）。利用这一特性，构建合适的DNA体系，将酒样加入其中处理，利用该DNA体系吸光度同酒样中酒精度之间的关联，从而实现酒精度的测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供30到40度酒酒精度的简便快速测定方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案为，30到40度酒酒精度简便快速测定方法的主要步骤如下：（1）移取400ul室温待测30到40度酒酒样到空的酶标板中，加入50ul初始变性剂和50ul短双链DNA片段混合体系并充分混匀后静置5min，同时设置对照孔为400ul待测酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水，待测酒样和对照均取平行测三次，样本处理好后将酶标板置于酶标仪中。（2）设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度减去对照的平均吸光度即为样品中短双链DNA片段混合体系的实际吸光度。将样品中DNA体系的实际吸光度x代入关系式y=9.0744x+28.527（30≤y≤40）中换算出酒样的酒精度y。其中，步骤（1）中所述的30到40度酒是指酒精度大于等于1且小于等于20的酒水类产品；所述酒样温度为正常室温即可，优选地，控制在30.0±5.0℃之间；所述的初始变性剂是8%质量体积分数的尿素和10%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液，即每100ml混合水溶液中含有8g尿素和10ml甲酰胺；所述的短双链DNA片段混合体系包括了2条短双链DNA片段1和2，其序列分别如SEQIDNO：1-2所示，各条短双链DNA片段浓度均为10μmol/l。本专利技术筛选到合适的短双链DNA片段混合体系，并揭示了其在30到40度酒中吸光度和酒精度之间的关系，在此基础上构建了30到40度酒酒精度的简便快速测定方法。本专利技术的酒精度测定方法适用于30到40度酒的测定，具有良好的准确性和可靠性，无需蒸馏比较安全，操作简便迅速，所需酒样量很少，且价格低廉，适合于酒厂30到40度酒酒精度测定实践。附图说明图1是本专利技术30到40度酒酒精度测定新方法的吸光度-酒精度标准曲线。横坐标是加短双链DNA片段混合体系和初始变性剂处理的人工酒样在260nm下的吸光度，纵坐标是其酒精度。图中的y=9.0744x+28.527是SPSS23.0软件拟合的吸光度x和酒精度y的关系式，R2=0.9992表示的是拟合曲线的决定系数。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。本专利技术在待测酒样和DNA体系中还加入经优化的特定浓度的尿素和甲酰胺混合液，主要是为了使DNA片段处于一个易于变性的环境中，从而使得乙醇测定方法具有更高的灵敏度。本专利技术提供的短双链DNA体系包含了2条DNA片段，按SEQIDNO：1-2递增的顺序其熔解温度是上升的，因此随着酒精度的增高，体系内变性双链的种类和数量也随之增加，因此吸光度和酒精度之间是正相关的。此外，DNA的变性是在一个窄的范围内实现的，因此需要进行筛选和条件优化，使得DNA体系中不同熔解温度的DNA片段在指定的条件下边界是有所叠加延续的。在乙醇这一温和变性剂的窄变动范围（10ml以内）和DNA超短片段（不足15bp），经研究发现乙醇变性剂浓度和特定DNA体系的熔解反应程度在一定范围内可以实现线性拟合。由于酒中乙醇和水占主体，固形物含量很低因此其对体系在260nm的吸光度影响很小。此外，设置了只加初始变性剂的酒样做为对照，可尽可能消除背景对吸光度的影响。在本专利技术体系和条件下，30度以下的酒精度尚不足以使任何短双链DNA片段发生局部变性，而40度以上的酒精度已经足以使所有短双链DNA片段完全变性，因此本专利技术提供的酒精度标准曲线只适用于30到40度酒的酒精度测定。在酒水产品质量检测中，分光光度法是常用的手段，可以测定包括色度、甲醇和特定氨基酸等，因此分光光度计是常规设备。实施例1实施例1是本专利技术30到40度酒酒精度简便快速测定方法中酒精度测定标准曲线的制作。（1）人工30到40度酒样配制用相应的移液管分别取30.0、32.0、34.0、36.0、38.0和40.0ml无水乙醇于100ml容量瓶中，不断加入蒸馏水反复轻微震荡和静置，最终定容到100ml，室温静置10min，即得到了不同酒精度的人工30到40度酒样。（2）人工30到40度酒样前处理用移液枪移取400ul待测30到40度人工酒样（30.0℃）到空的普通酶标板中，先加入8%质量体积分数的尿素和10%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液50ul作为初始变性剂，再加入如SEQIDNO：1-2所示的短双链DNA片段混合体系（每条片段的浓度均为10μmol/l）50ul，则总体系为500ul，充分混匀后静置5min。需要说明的是8%质量体积分数的尿素和10%体积体积分数的甲酰胺是指100ml蒸馏水中溶解有8g的尿素和10ml的甲酰胺，短双链DNA片段是由上海生工生物工程有限公司合成的互补单链等量混合而成。同时设置对照孔为400ul人工30到40度酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水，即对照为用蒸馏水取代短双链DNA片段混合体系，各人工30到40度酒样和相应的对照均取平行三次，样本制备好后将酶标板置于酶标仪（美国Thermo公司的MultiskanGO）中。（3）拟合酒精度测定方法标准曲线设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度（三个平行取平均）减去对照的平均吸光度（三个平行取平均）即为样品中DNA体系的实际吸光度，如表1所示。对吸光度和对应的酒精度的散点进行观察，发现30.0、32.0、34.0、36.0、38.0和40.0这6个酒精度对应的点呈现线性趋势，进行拟合得到酒精度y和吸光度x之间的关系式为y=9.0744x+28.527（30≤y≤40），而R2=0.9992非常接近1表明线性关系显著，则此即酒精本文档来自技高网...

【技术保护点】
30到40度酒酒精度简便快速测定方法，其特征在于酒精度简便快速测定方法的主要步骤为：（1）移取400ul室温待测30到40度酒酒样到空的酶标板中，加入50ul初始变性剂和50ul短双链DNA片段混合体系并充分混匀后静置5min，同时设置对照孔为400ul待测酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水，待测酒样和对照均取平行测三次，样本处理好后将酶标板置于酶标仪中；（2）设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度减去对照的平均吸光度即为样品中短双链DNA片段混合体系的实际吸光度；将此实际吸光度x代入关系式y=9.0744x+28.527中换算出待测酒样的酒精度y，30≤y≤40范围内有效。

【技术特征摘要】
1.30到40度酒酒精度简便快速测定方法，其特征在于酒精度简便快速测定方法的主要步骤为：（1）移取400ul室温待测30到40度酒酒样到空的酶标板中，加入50ul初始变性剂和50ul短双链DNA片段混合体系并充分混匀后静置5min，同时设置对照孔为400ul待测酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水，待测酒样和对照均取平行测三次，样本处理好后将酶标板置于酶标仪中；（2）设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度减去对照的平均吸光度即为样品中短双链DNA片段混合体系的实际吸光度；...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海霞，黄种山，
申请(专利权)人：黄海霞，
类型：发明
国别省市：福建,35