可促进人肺腺癌细胞分化的cDNA及其真核表达载体及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种能促进人肺腺癌细胞分化的ｃＤＮＡ，包含该ｃＤＮＡ的真核表达载体以及该ｃＤＮＡ在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。所述的ｃＤＮＡ是从维甲酸处理的人肺腺癌细胞系中分离得到。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种能促进人肺腺癌细胞分化的cDNA，包含该cDNA的真核表达载体以及该cDNA在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。所述的cDNA是从维甲酸处理的人肺腺癌细胞系中分离得到。肺癌对人类生命、健康的威胁日趋严重，在工业发达国家和地区，男性肺癌发病率高居各类肿瘤之首，女性肺癌发病率仅次于乳腺癌而居第二位。在我国，肺癌发病率有超过胃癌而跃居第一位的趋势。肺癌患者预后很差。其五年生存率仅为10-15％，其中小细胞肺癌五年生存率低于5％。20余年来，尽管对某些肿瘤的治疗取得了成功或取得重大进展，但传统的手术、放疗和化疗三大疗法并未能改善大多数肺癌患者的预后，降低死亡率。近20年来，肿瘤分子生物学研究取得了重大进展。现已明确，癌的发生是细胞增殖失控和分化障碍的结果，细胞癌基因的激活和抑癌基因的失活是造成细胞生长与分化调控紊乱的根本原因。因此，应用各种方法分离肿瘤抑制基因或促分化基因，对于阐明肿瘤发生的内在机制和设计有效防治措施都具有重要意义。维甲酸(Retinoic Acid.，RA)是维生素A的代谢产物，对人体的正常形态发生、发育和细胞分化起重要调节作用。近10多年的研究结果表明，RA对某些完全转化的、具有转移性的肿瘤细胞产生增生抑制或诱导终末分化作用，能够使某些肿瘤的恶性程度降低或去恶性化。尽管并不是各种肿瘤都对RA有这样的反应，然而，这些发现无疑对肿瘤治疗提供了一个新线索。在很多情况下，恶性肿瘤是一种细胞异常分化的疾病，对于那些具有侵袭性的细胞可以通过调节其细胞分化而不是应用细胞毒药物杀死细胞的方法得到控制。由此为RA的肿瘤分化治疗作用提供了理论依据。由于RA对多种肿瘤的增殖抑制和/或分化诱导作用，使其成为某些恶性肿瘤的分化诱导剂和化学预防剂。中国医学科学院肿瘤研究所林培中等(中华肿瘤杂志10(3)161-166，1988；中国医学科学院学报12(4)235-245，1990)从80年代初即开始用我国新研制的维甲类化合物在食管癌高发区进行食管癌的阻断性研究，使有食管粘膜重度增生者的癌变率明显降低；黄萌茸等(Huang ME，Ye YuChen et al，Blood 73567-572，1988)在国际上首次用全反式维甲酸治疗急性早幼粒白血病患者取得成功。但RA对细胞增殖分化调节的分子机制一直是个谜。近10年来，随着维甲酸受体基因的克隆，对这个问题的认识发生了质的飞跃。目前认为，维甲酸作用的机制是维甲酸与细胞核内的维甲酸受体结合后作为转录因子与特异性顺式作用DNA序列结合，调节靶基因的转录活性。虽然受调控基因的具体数量和顺序尚未弄清，但一般认为维甲酸是启动了级联(Cascade)式的转录调节，导致一系列分化基因的激活和增殖基因的受抑。至今已有越来越多的RA靶基因得到认识，也分离、克隆出了一些引起细胞分化的新基因。这不仅使肿瘤细胞分化治疗的理论认识深化了一步，也有可能成为一类恶性肿瘤基因治疗的目的基因。80年代末，本室在发现RA可引起食管癌细胞系生长的抑制及终末分化的基础上，应用cDNA消减杂交技术，已从诱导分化的食管癌细胞系中分离出一个具有抑癌作用的cDNA片段(见中国专利申请95101293.2)。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种可促进人肺腺癌细胞分化的cDNA，所述的cDNA是从维甲酸处理的人肺腺癌细胞系中分离得到，其对人肺腺癌细胞等肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用。本专利技术的第二个目的在于提供包含所述的cDNA的真核表达载体。本专利技术的第三个目的在于该cDNA在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。相应地，根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种可促进人肺腺癌细胞分化的cDNA，其全长为709bp，核苷酸序列见序列表(SEQ ID NO1)。所述的cDNA是通过用全反式维甲酸诱导人肺腺癌细胞系GLC-82使其发生分化，从其cDNA文库中利用cDNA消减杂交分离得到。cDNA消减杂交是在mRNA水平分离两种状态下特异表达或抑制表达基因的策略。在正常细胞或肿瘤细胞分化过程中，涉及一些分化相关基因的表达，本专利技术人所在科室已用该方法从RA诱导分化的食管癌细胞系中分离出具有抑癌活性的cDNA-RA538，开辟了一条从诱导分化的肿瘤细胞中分离促分化基因的新途径(中国专利申请95101293.2)。Steinman等(Steinman RA，et al，Oncogene，93389-3396)对黑色素瘤细胞进行诱导分化，用消减杂交方法也得到一些差异表达的cDNA，称为黑色素瘤分化相关基因(mda)，而其中的一个cDNA恰巧是p21，WAF/CIPI(野生型p53激活因子)，该基因在RA，DMSO诱导分化的HL-60细胞中呈即刻快速表达。Schraml等(Schraml P，et al，Cancer Res.，545236-5240，1994)用正常肺组织与非小细胞肺癌组织的cDNA作消减杂交，分离出17个差异表达的cDNA克隆，其中六个在非小细胞肺癌中表达缺失，表明它们可能与非小细胞肺癌的发生有关。基于RA作用的分子机制，根据cDNA消减杂交原理，本专利技术人采用肺腺癌细胞诱导分化与cDNA-cDNA消减杂交相结合的策略，首先构建了未经RA诱导及RA诱导不同时间细胞的cDNA文库，通过cDNA文库消减杂交，获取分化启动阶段和分化早期细胞基因表达变化的信息。其次，采用cDNA文库间直接比较(cDNA文库消减杂交)的策略，通过按比例加大靶DNA、即RA诱导文库单链DNA的投入量，增加了获取由低丰度mRNA转录的cDNA的机率，因而可望发现在RA诱导不同时间，即细胞分化的不同阶段被激活而特异表达的基因。RA特异性cDNA消减文库的建立，使细胞分化过程中基因表达变化的信息得到富集，使反映细胞分化过程中基因表达的动态变化特征成为可能，这为进一步筛选分化相关基因提供了方便。经一系列筛选，本专利技术人从RA诱导表达的cDNA消减文库中分离到一个在RA诱导后呈早期持续表达的cDNA克隆(命名为RA42)。经查询美国国家生物信息中心(NCBI)的最新(1995.8)核苷酸序列数据库(Nucleotide Sequence Database)，未见同源序列，表明RA42是新发现的cDNA序列。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及包含所述的cDNA的真核表达载体，在本专利技术的实施例中采用的真核表达载体为pMSG(7.6kb，购自Pharmacia)，将RA42克隆cDNA两端各加衔接头(adaptor)，使其两端均为SalI位点，直接与经SalI酶切的pMSG连接，利用限制酶切反应鉴定插入片段的正反向，并将正向重组质粒命名为pMSG-RA42，即GLC-ada-RA42，根据布达佩斯条约，该质粒已于1996年4月5日在中国典型培养物中心保藏(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC M96005。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还涉及所述的cDNA序列在制备基因治疗人肺腺癌的制剂中的应用。附图的简要说明附图说明图1为本专利技术采用的cDNA定向克隆技术的示意图。图2示出用菌落原位杂交/加-减法差异筛选cDNA消减克隆，图中(a)为消减克隆与RA诱导文库总cDNA探针杂交的结果，(b)为消减克隆与未诱导文库总cDNA探针杂交的结果。图3为Nort本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进人肺腺癌细胞分化的ｃＤＮＡ，其特征是所述的ｃＤＮＡ的序列为：ＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣ ＧＣＧＴＣＣＧＧＡＡ ＡＴＣＴＣＣＡＡＧＴ ＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡ ＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣ ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴ ６０ＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧ ＡＡＣ ＡＣＣＣＣＡＣ ＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴ ＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴ ＣＴＧＧＣＴＴＧＧＧ ＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣ １２０ＡＡＧＴＡＣＣＣＴＧ ＴＣＴＡＡＧＣＴＣＧ ＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣ ＧＣＣＣＧＴＴＴＣＴ ＣＡＧＣＴＡＣＴＣＣ ＣＴＴＧＡＧＣＣ ＣＣ １８０ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＡ ＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣ ＣＧＡＧＧＣＴＡＴＣ ＴＡＣＧＧＧＴＴＴＴ ＴＴＴＣＡＧＧＡＣＡ ＡＡＴＧＡＴＧＣＧＡ ２４０ＡＧＧＴＴＧＧＴＡＣ ＡＴＴＡＧＴＧＧＧＧ ＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡ ＴＧＧＡＡＡＣＡ ＡＡ ＴＡＣＴＡＴＧＡＡＧ ＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡ ３００ＡＴＴＴＴＴＴＧＧＧ ＣＧＴＣＡＣＣＧＡＴ ＧＧＧＴＴＧＴＡＴＡ ＴＡＣＴＡＣＴＧＡＡ ＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣ ＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴ ３６０ＴＣＴＧＧＧＡＴＧＴ ＧＧＡＴＧＧＡＡ ＧＣ ＡＴＧＧＴＧＣＣＴＣ ＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡ ＴＣＧＴＴＧＧＣＴＴ ＣＡＣＡＧＴＡＴＧＡ ４２０ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣ ＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡ ＡＡＡＣＣＡＣＴＴＡ ＣＴＧＣＴＣＧＴＡＡ ＡＴＴＣＡＴＴＴＧＧ ＡＣＧＡＡＣＣＡＴＡ ４８ ０ＡＡＴＴＣＡＡＣＧＴ ＧＡＣＴＧＧＧＣＣＣ ＣＡＧＡＡＣＡＡＴＡ ＴＧＴＡＣＣＴＴＡＴ ＴＣＴＡＣＣＡＣＴＡ ＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴ ５４０ＴＣＡＧＧＡＧＴＧＧ ＡＴＣＣＣＡＣＣＴＴ ＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡ ＣＡＡＧＴＡＡＡＧＡ ＣＡ ＡＴＧＡＡＧＡＡ ＣＡＧＴＴＧＡＡＡＣ ６００ＡＴＧＣＡＡＡＡＴＡ ＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴ ＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡ ＣＴＣＴＴＴＴＡＣＴ ＧＴＴＴＡＣＣＡＴＴ ＣＡＣＴＡＴＡＡＴＴ ６６０ＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡ ＡＴＴＧＴＧＴＧＡＣ ＴＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ７０９。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：黎伯铨，王秀琴，吴旻，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]