重组MVA病毒及其应用制造技术

一种重组ＭＶＡ病毒，含有并能够表达至少一种插入到ＭＶＡ基因组中自然发生缺失位点的外源基因。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从改良安卡拉痘苗病毒(MVA)衍生的重组痘苗病毒及其包含且能够表达插入到MVA染色体上自然发生缺失位点上的外源基因；涉及使用这类重组MVA病毒产生多肽，例如抗原或治疗剂，或产生用于基因治疗的病毒载体，以及使用这类编码抗原的重组MVA病毒作为疫苗。本专利技术的目的之一是提供一个重组MVA病毒，它可作为有效且特别安全的表达载体。本专利技术的另一个目的是提供一种简单、有效、安全的方法产生多肽，例如抗原或治疗剂，产生重组病毒用作疫苗以及产生病毒载体用于基因治疗。本专利技术的再一个目的是提供一个基于表达T7RNA聚合酶的重组MVA病毒的表达系统，以及基于此表达系统产生多肽，例如抗原或治疗药剂，或产生病毒载体用于基因治疗或用作疫苗。痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒属的一员，曾用作活疫苗免疫人天花病。世界范围用痘苗病毒成功的接种最终导致天花病因-天花病毒的绝迹。因而世界卫生组织(WHO)宣告，除了有高度危险痘病毒感染的人群(例如实验室人员)外，已全世界性地停止接种。最近，痘苗病毒也已用于设计病毒载体，以进行重组基因表达和可能用作重组活疫苗。这必然伴有在DNA重组技术帮助下把编码外源抗原的DNA序列(基因)引入痘苗病毒基因组。如果基因整合到病毒DNA中对病毒生活周期非必需的位点，可能新产生的重组痘苗病毒是感染性的，即能够感染外源细胞并从而表达整合的DNA序列。用这种方法制备的重组痘苗病毒一方面可用作活疫苗预防传染性疾病，另一方面可用于在真核细胞中制备异源蛋白质。表达噬菌体T7 RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒可以建立广泛应用的表达系统以用于在哺乳动物细胞中合成重组蛋白(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，MMizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R.自然(Nature)348，91-92.)。在所有方案中，重组基因表达依赖于真核细胞细胞质中T7 RNA聚合酶的合成。最普遍的一个方案是用于瞬时表达(Fuerst，T.R.，Niles，E.G.，Studier，F.W.和Moss，B.美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.)Sci.USA 83，8122-8126和美国专利申请(US patent application)7.648.971)。首先，一个感兴趣的外源基因插入质粒并在T7 RNA聚合聚启动子控制之下。随后，质粒引入到细胞的原生质体中，该细胞通过标准转染方法由产生T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒预先感染。此转染方案非常简单因为不需构建新的重组病毒并且特别有效，有超过80％的细胞表达感兴趣的基因。痘苗病毒/T7 RNA聚合酶杂合系统比其它瞬时表达系统的优势很可能在于它不依赖于质粒到细胞核的转运。在过去，该系统在病毒学和细胞生物学中对检测目的是极其有用的(Bunocore，L.和Rose，J.K.自然(Nature)345，625-628，Pattnaik，A.K.和Wertz，G.W.美国国家科学院院报(Proc Natl.Acad.Sci.USA)88，1379-1383，Karschin，A.，Aiyar，J.，Gouin，A.，Davidson，N.和Lester，H.A.欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)278，229-233，Ho，B.Y.，Karschin，A.，Raymond，J.，Branchek，T.，Lester，H.A.和Davidson，N.欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)301，303-306，Buchholz，C.J.，Retzler C.，Homann，H.E.，和Neubert，W.J.病毒学(Virology)204，770-776)。然而，痘苗病毒/T7 RNA聚合聚杂合系统的重要前景应用，例如产生重组蛋白或重组病毒颗粒用于人体的新的治疗或预防方法，可能由于重组痘苗载体的大量复制而受到阻碍。痘苗病毒对人是感染性的并且在根除天花运动中的接种时偶而会观察到严重的并发症。关于并发症发病率的最好综述由一项美国国家调查提供，该调查检测了大约一千二百万接种疫苗的人，接种疫苗基于纽约城市卫生委员会痘苗病毒菌株(Lane，J.，Ruben，F.，Neff，J.和Millaar，J.新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)281，1201-1208)。因而安全性考虑和规范影响了使用痘苗病毒作为载体发展重组活疫苗的最令人鼓舞的可能性。此外，文献中描述的大多数重组痘苗病毒基于西方保藏的痘苗病毒菌株(Westem Reservestrain ofvaccinia virus)。另一方面，众所周知此菌株有较高的神经毒性因而不适用于人类和动物(Morita等，疫苗(Vaccine)5，65-70)。对于载体应用，通过使用高度减毒的痘苗病毒菌株可以减小健康危险。特别发展了许多这类痘苗病毒以避免天花接种中的不希望的副作用。因而，通过痘苗病毒安卡拉菌株(CVA)在鸡胚成纤维细胞中长期的连续传代产生了改良安卡拉痘苗病毒(VVA)(综述参看Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.感染(Infection)3，6-14；瑞士专利号(Swiss Patent No.)568，392)。MVA病毒按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于1987年11月15日保藏于CNCM(巴斯德研究所，微生物菌种国家收藏馆(Institut Pasteur，Collection Nationale de Culturesde Microorganisms，)25，rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)，保藏号1-721。MVA的特点是强减毒性，也就是说通过减少的毒性或感染性同时保持良好的免疫原性。检测了MVA病毒以确定它相对于野生型CVA菌株基因组的变化。检测到六个主要的共31,000碱基对的基因组DNA缺失(缺失I，II，III，IV，V和VI)(Meyer，H.，SuTTer，G.和Mayr A.普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)72，1031-1038)。产生的MVA病毒其宿主细胞严格限于禽源细胞。另外，MVA具有高度减毒的特征。在多种动物模型中的检验证明MVA甚至在免疫抑制的动物中都是无毒性的。更重要的是，MVA菌株的优秀特性已在广泛的临床试验中得到证实(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.l，Abt.Org.B167，375-390，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。在这些超过120,000人的研究中，包括高危病人，没发现有与MVA疫苗相关的副作用。已发现MVA在人细胞中的复制在感染后期受到阻碍，防止了成熟感染性病毒粒子的组装。尽管如此，MVA甚至在非允许细胞中也能高水平表达病毒的和重组的基因，并建议作为有效的和特别安全的基因表达载体(Sutter，G.和Moss，B.美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851)。最近，在MVA基础上构建了新的痘病毒载体系统，外源DNA序列插入MVA基因组的缺失III或TK基因(Sutter，G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：格尔德·萨特，马里恩·奥尔曼，沃尔克·厄夫勒，
申请(专利权)人：GSF环境与健康研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：