转基因小球藻的高效生物反应器制造技术

本发明专利技术将外源目的基因导入到小球藻中，建立了成熟的小球藻外源基因转化体系，可将目前从动物、植物、微生物中分离到的基因通过基因枪、电击穿孔等多种转化技术导入小球藻中，使其成为新型高效的生物反应器，可通过转基因小球藻的迅速大量繁殖来生产有用产品，特别是紧俏价高的各种生物活性物质、生长因子等药物的规模生产。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中生物体转化及生产技术。即以导入外源基因的小球藻为生物反应器，通过转基因藻的繁殖，规模生产目的基因的产物。小球藻在植物分类学上属绿藻纲绿球藻目小球藻科，是具有原始形态的单细胞真核藻类，大约在20亿年前就出现在地球上。通常在淡水中进行浮游生活，形状呈球形或椭圆形，直径3-12微米，细胞壁平滑，进行无性分裂繁殖，分裂周期为10-20小时。目前世界上已知的小球藻有15种左右，加上它的变种可达数百种之多，且分布范围广泛，生态习性多样。小球藻具有很强的光合作用能力，它通过空气中的二氧化碳和水在阳光的照射下能合成包括蛋白质在内的各种有机物。如用有机物做为碳源也能进行无光繁殖。因此，小球藻的培养容易，生产成本低。近年来，随着藻类分子遗传学的发展，将外源基因导入藻类并高效表达，把藻类作为新型的生物反应器，生产贵重的药品，保健品和精细化工产品，以及通过基因工程方法提高藻类蛋白含量，改善其营养品质是近年来藻类生物技术发展的主要趋势之一。做为单细胞真核藻类与大型藻类相比具有以下特点一，其培养条件简单，生产成本低；二，繁殖迅速、再生快；三，体积相对较小，结构简单，便于基因表达产物的提取。本专利技术的目的是建立成熟的小球藻外源基因转化体系，将目前从动物、植物、微生物中分离到的基因通过基因枪、电击穿孔等多种转化技术导入小球藻中，使其成为新型高效的生物反应器，低成本地规模生产有用产品，特别是来源紧俏、造价昂贵的药物。本专利技术的特点在于一，利用目前国际上公认较为成熟的基因转化法(基因枪法、电击穿孔法)做为转基因方法，其共同点是操作简便，不受宿主限制，且具有较高的转化率；二，直接利用有壁细胞作为转化受体，避免了复杂的原生质体分离和培养再生技术。本专利技术主要包括以下四方面的技术一、小球藻的培养技术；二、用基因枪法将外源目的基因导入小球藻的技术；三、用电击穿孔法将外源目的基因导入小球藻的技术；四、转基因小球藻的筛选、分离纯化技术。实施例1小球藻的培养技术小球藻培养基成份为克氏培养液Ca(NO3)21.0g/l，K2HPO40.2g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l，KCl 0.12g/L，FeCl310mg/l，附加0.1％的酵母提取物和0.4％的葡萄糖。固体培养克氏培养液附加1.8％的琼脂，划线培养使藻成单藻落。液体培养将在固体培养基中生长的直径约1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中悬浮培养，培养条件如下转速120-130rpm，温度20-25℃，每天光照培养16小时，光照条件3000-4000lux，黑暗培养8小时。由于藻类极易与菌类共生，因此在未长出菌落之前，将单藻落在固体培养基上划线，经几次继代直到无菌落出现为止。实施例2用基因枪法将外源目的基因导入小球藻的技术取培养第四天的小球藻培养液，1000rpm离心10min，弃上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养液处理2hr，1000rpm离心10min，弃上清，加入一定量的小球藻液体培养液，使其密度达到107-108个/ml，吸取0.4ml培养物铺于含抗生素的固体培养基的培养皿中央，直径为3cm的圆形有效轰击范围内，置超净台下吹干待用。采用美国Bio-Rod公司的PDS-1000型基因枪。整个轰击过程为无菌操作。微粒子弹的准备过程如下取50μl 60mg/ml的金粉悬浮液，加入4-5μg pBI221质粒(1μg/μl)，该质粒装有CaMV35S启动子、GUS(β-葡萄糖甘酸酶)基因以及NOS(胭脂碱合成酶)终止子，50μl 2.5M CaCl2及20μl 0.1M亚精胺，振荡3min，10000rpm离心10sec，去上清，250μl无水乙醇洗一次，振荡，10000rpm离心，去上清，并重复一次，金粉最后悬浮于60μl无水乙醇中。每次轰击取5-10μl，每皿轰击一次，轰击时子弹与靶细胞的距离为6cm。轰击后将培养皿放入小球藻适宜培养条件下培养。实施例3用电击法将外源目的基因导入小球藻的技术材料准备同实施二，只是在渗透剂处理后，加入电击缓冲液(Electroporationbuffer)，成份为80mM KCl，5mM CaCl2，10mM HEPES(N-2-Hydrox-yethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid)，0.425M Mannitol，pH 7.2)，使其密度达107-108个/ml。同时加入终浓度为10μg/ml的质粒DNA及25μg/ml的鲑精DNA，混匀后，在冰上放置5-10min，吸取0.4ml置于轰击小室中待用。采用Baekon 2000型电击仪进行电击，电压为9.5KV，每次电击时间为0.05μsec，电击次数为210，循环次数为100次，电击高度为2mm，每次电击间隔时间为62.5sec。实施例4转基因小球藻的筛选分离与纯化取基因枪和电击转化法的小球藻0.4ml，铺于含有25μg/ml G418的固体培养基的培养皿中央3cm的圆形范围内，进行筛选培养。在适宜培养条件下，3-4周后出现若干藻落，将此藻落分别悬浮培养于不含抗生素的20ml液体培养基中，3-4天后，加入25μg/ml的G418进行进一步筛选，以后不断继代培养，大量繁殖。权利要求1.一种转基因小球藻的生物反应器，这种小球藻含有外源目的基因、筛选标记基因，并能产生外源基因的产物。其特征在于利用基因枪或电击穿孔等转化方法将外源目的基因导入小球藻，通过筛选标记，使转基因小球藻得以分离、纯化、大规模繁殖，从而达到规模生产目的基因产物的目的。2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于用基因枪法将外源基因导入小球藻并得到表达。3.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于用电击穿孔法将外源基因导入小球藻并得到表达。4.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于用转座子介导法等其他常用技术将外源基因导入小球藻并得到表达。5.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自人与哺乳动物的基因，如防御素基因、生长因子等基因导入小球藻中，并得到表达。6.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自昆虫的基因，如抗菌肽基因等导入小球藻中，并得到表达。7.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自高等植物的基因，如种子贮藏蛋白基因等导入小球藻中，并得到表达。8.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自微生物的基因，如杀幼蚊毒素基因等导入小球藻中，并得到表达。9.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于导入外源基因后，以NPT-II基因作为转基因小球藻的筛选标记，可以用G418筛选出转基因小球藻。10.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于导入外源基因后，以Hygr基因作为转基因小球藻的筛选标记，可以用潮霉素筛选出转基因小球藻。11.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于导入外源基因后，以CAT基因作为转基因小球藻的筛选标记，可以用氯霉素筛选出转基因小球藻。全文摘要本专利技术将外源目的基因导入到小球藻中,建立了成熟的小球藻外源基因转化体系,可将目前从动物、植物、微生物中分离到的基因通过基因枪、电击穿孔等多种转化技术导入小球藻中,使其成为新型高效的生物反应器,可通过转基因小球藻的迅速大量繁殖来生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因小球藻的生物反应器，这种小球藻含有外源目的基因、筛选标记基因，并能产生外源基因的产物。其特征在于利用基因枪或电击穿孔等转化方法将外源目的基因导入小球藻，通过筛选标记，使转基因小球藻得以分离、纯化、大规模繁殖，从而达到规模生产目的基因产物的目的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勇如，陈颖，马江生，白琴华，郭殿京，赵世民，张利明，李忠阳，傅荣昭，舒群芳，李文彬，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]