一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法技术

本发明专利技术提供一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法，是一种同时利用多酶组装技术与代谢途径改造技术实现在大肠杆菌中高效生产衣康酸的方法，包括以下步骤：1)将合成衣康酸的三个关键酶在细胞内进行自组装形成多酶复合体，三个关键酶包括：柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA；2)利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌进行代谢途径改造；以及3)将多酶复合体转入代谢途径改造的大肠杆菌构建一种大肠杆菌工程菌，通过发酵进行衣康酸的生产。本发明专利技术将合成衣康酸的三个关键酶作为装配对象，同时利用Crispr/cas9技术改造代谢途径，实现在大肠杆菌中衣康酸的高效生产，为衣康酸的工业化生产提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】
一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法
本专利技术涉及基因工程领域，更具体地涉及一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法。
技术介绍
衣康酸(甲叉丁二酸、亚甲基琥珀酸)是一种不饱和二元羧酸，是化工领域的重要工业原料和添加剂，作为构造模块被广泛应用于生产塑料、化纤、超吸附剂、乳胶、防垢剂等方面。衣康酸作为一种可再生材料，已得到了越来越多的关注。2004年，衣康酸被美国能源部评选为最具发展潜力的12种生物基平台化合物之一。目前，全世界衣康酸的产能为5万吨/年，还面临至少3万吨的缺口，且衣康酸可以替代丙烯酸和甲基丙烯酸用于可降解塑料的生产，其未来需求量将会继续快速增长，是一种具有广阔应用前景的重要生物质来源有机酸。目前，国内外工业化生产衣康酸的主导方法是土曲霉发酵法。生物合成衣康酸的主流学说认为是通过糖酵解和TCA循环的路线，即以柠檬酸和乌头酸为代谢中间产物，后者通过乌头酸脱羧酶cadA脱羧形成衣康酸。然而，与其他有机酸发酵生产相比，目前国际上利用土曲霉发酵生产衣康酸的发酵单位仍然较低，其原因在于：1)土曲霉发酵时间长，时空产率不高；2)在真菌细胞中acnA定位于线粒体中，而cadA则是定位于胞质中，两个酶定位的不同使两个酶的底物与中间产物的扩散和反应变得更为困难。因此，有研究者选择大肠杆菌作为生产衣康酸的宿主菌，其优点在于：1)生长周期短，时空产率高；2)遗传背景清楚，基因改造较为容易，且不存在不同酶定位在不同细胞器的问题；3)大肠杆菌具有很好的有机酸耐受性，具备生产较高浓度衣康酸的潜力。但目前这些研究还只是关注采用传统的生物技术手段，如提高关键酶的表达和代谢途径改造等方面。虽然可以在大肠杆菌中达到克级的发酵水平，但距离生产要求还有一定的差距。多酶组装技术是近些年发展起来的一种可以显著提高多酶级联催化效率的方法。多酶级联反应体系可以解决底物在多个酶之间的传递问题，减小传质距离，增加局部范围内底物的浓度，缩短底物的转运和反应时间，提高各单一酶的催化效率，已越来越多地应用于需多步单酶催化完成的生化反应中。其中使用到的相互作用多肽或蛋白广泛存在于自然界，而且其类型丰富多样，分子量从几KD到几百KD不等，相互作用的方式也各有特点，适合作为相互作用的装配元件，例如本专利技术中使用的源自后生动物细胞的PDZ相互作用蛋白对和源自小鼠信号蛋白的SHM相互作用蛋白对。人工构建高效的异源多酶级联反应系统也是合成生物学的主要研究内容和研究热点之一。将衣康酸合成途径中的关键三个酶进行组装，构建具有一定区室化效应的高效多酶体方面目前还没有研究报道。如果能在大肠杆菌中将衣康酸合成路径中的关键三个酶都组装在一起，形成一个结构紧密、排列有序并具有一定区室化微环境的人工多酶体，使衣康酸合成途径与TCA循环的部分路径紧密连接，则可大幅减少中间体—柠檬酸和顺式乌头酸的传质距离和运输时间，增加多酶体微环境内的底物浓度，使产生的中间物能即时地被下一个酶所催化，提高级联催化反应效率，增强衣康酸合成路径代谢流，使平衡朝衣康酸合成方向进行，将有望使衣康酸的时空产率得到大幅提高，具有广泛的应用前景和工业价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法，从而解决现有技术中生产衣康酸的方法还无法满足高产量工业化生产的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：提供一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法，所述方法是一种同时利用多酶组装技术与代谢途径改造技术实现在大肠杆菌中高效生产衣康酸的方法，具体地，所述方法包括以下步骤：1)将合成衣康酸的三个关键酶在细胞内进行自组装形成多酶复合体，所述三个关键酶包括：柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA；2)利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌进行代谢途径改造；以及3)将所述多酶复合体转入经过代谢途径改造的大肠杆菌构建一种大肠杆菌工程菌，通过发酵进行衣康酸的生产。所述步骤1)包括利用两对相互作用蛋白SH3/SH3lig和PDZ/PDZlig融合柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA，分别形成gltA-PDZ-SH3，acnA-PDZlig，cadA-SH3lig。所述步骤2)是利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌敲除部分糖酵解过程，三羧酸循环以及副产物支路上的基因。利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌的代谢途径改造包括抑制乳酸副产物通路、甲酸副产物通路、乙酸副产物通路，以及增强pepC途径和PEP途径。在所述代谢途径改造中敲除的基因包括：乳酸脱氢酶基因ldhA，丙酮酸甲酸裂解酶pflB，丙酮酸氧化酶基因poxB，异柠檬酸裂解酶基因icL和异柠檬酸脱氢酶基因icd中的至少一种。在所述代谢途径改造中敲除的基因同时包括：乳酸脱氢酶基因ldhA，丙酮酸甲酸裂解酶pflB，丙酮酸氧化酶基因poxB，异柠檬酸裂解酶基因icL和异柠檬酸脱氢酶基因icd。所述大肠杆菌工程菌的发酵条件为：采用基本培养基，pH7.0，30℃下发酵培养40～100h。所述基本培养基的成分包括：6.8g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1g/LNH4Cl，0.49g/LMgCl，0.1mmol/LCaCl2，1mg/L硫胺素，30g/L的葡萄糖，4g/Lα-酮戊二酸，1000×微量元素(2.86gH3BO3，1.81gMnCl2·4H2O，0.222gZnSO4·7H2O，0.39gNa2MoO4·2H2O，0.79gCuSO4·5H2O，0.049gCo(NO3)2·6H2O)。所述大肠杆菌工程菌的发酵包括以下步骤：1)首先在37℃，300～500rpm条件下培养15～20h使菌体生物量增长；2)15～20h后，将温度改为30℃，550rpm发酵，流加4MNaOH实时控制发酵液pH＝6.7，不断通入无菌空气使溶氧控制在30％以上；3)每隔6h取样，测量葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于10g/L时，手动补加300g/L葡萄糖，52.5g/L(NH4)2SO4，4g/Lα-酮戊二酸，使得葡萄糖浓度不低于20g/L；以及4)发酵100小时后，测得葡萄糖消耗完毕，发酵结束。本实验室之前的研究表明，在大肠杆菌中将衣康酸合成途径中的三个关键酶中的两个酶-acnA与cadA进行组装，其催化柠檬酸生成衣康酸的效率和产量都有显著提高。但是，仍然没有达到工业生产的水平，因此本专利技术提供了一种新的思路，即同时使用多酶组装与代谢途径改造两种策略，将衣康酸通路构建在大肠杆菌中，组装关键酶并调节代谢通量的流向，从而达到高效生产的目的。本专利技术的主要思路具体如下：(1)在计算机模拟建立gltA、acnA和cadA的3D结构模型的基础上，根据同源建模分别在三个酶的结构表面寻找与PDZ或SHM的结构域或配体融合的合适位点(或区域)，以及选择恰当的链接元件，使得它们在与PDZ或SHM蛋白对融合(末端融合或是插入融合)之后，结构和活力不发生大的改变，并保持相互作用元件的结构完整并充分暴露在融合蛋白表面，易于实现相互识别和组装，且在组装后三个酶的活性中心之间呈现出一定的距离和朝向。依据级联反应路线及寡聚酶自聚特性，科学设计组装方案，经过融合蛋白的建模和分析，并筛选出最佳的融合方式。(2)根据获得的理性设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法，其特征在于，所述方法是一种同时利用多酶组装技术与代谢途径改造技术实现在大肠杆菌中高效生产衣康酸的方法，所述方法包括以下步骤：1)将合成衣康酸的三个关键酶在细胞内进行自组装形成多酶复合体，所述三个关键酶包括：柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA；2)利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌进行代谢途径改造；以及3)将所述多酶复合体转入经过代谢途径改造的大肠杆菌构建一种大肠杆菌工程菌，通过发酵进行衣康酸的生产。

【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌中生产衣康酸的方法，其特征在于，所述方法是一种同时利用多酶组装技术与代谢途径改造技术实现在大肠杆菌中高效生产衣康酸的方法，所述方法包括以下步骤：1)将合成衣康酸的三个关键酶在细胞内进行自组装形成多酶复合体，所述三个关键酶包括：柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA；2)利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌进行代谢途径改造；以及3)将所述多酶复合体转入经过代谢途径改造的大肠杆菌构建一种大肠杆菌工程菌，通过发酵进行衣康酸的生产。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括利用两对相互作用蛋白SH3/SH3lig和PDZ/PDZlig融合柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA，分别形成gltA-PDZ-SH3，acnA-PDZlig，cadA-SH3lig。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过对柠檬酸合酶gltA、顺式乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA进行自组装形成的多酶复合体为cadA-SH3lig-gltA-(linker-PDZ-linker-SH3)+acnA-PDZlig。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)是利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌敲除部分糖酵解过程，三羧酸循环以及副产物支路上的基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用Crispr/cas9技术对大肠杆菌的代谢途径改造包括抑制乳酸副产物通路、甲酸副产物通路、乙酸副产物通路。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述代谢途径改造中敲除的基因包括：乳酸脱氢酶基因ldhA，丙酮酸甲酸裂解酶pflB，丙酮酸氧化酶基因poxB，异...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宇红，魏东芝，杨中伟，王红玲，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31