一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法技术

本发明专利技术公开了一种氯化藻类有机质溶液、及其制备方法和毒性分析方法。本发明专利技术的氯化藻类有机质溶液是通过先采用氮气吹干的方法获得小球藻藻体，液氮研磨后复溶，保持溶液总有机碳含量为40～60mg/L，氯化，并以碱性溶液进行中和，制备了一种稳定的Cl‑AOM溶液，本发明专利技术的Cl‑AOM毒性分析是通过PCR技术检测Cl‑AOM暴露caco‑2细胞后其P450系统中CYP1A1和CYP1B1的表达量来实现的，其在Cl‑AOM混合溶液水平直接进行毒性检测，大大节省了时间。此外，PCR技术能够检测到微量的基因表达差异，具有检测限低、准确度高和灵敏度好的特点，能够对痕量毒性物质引起的基因表达差异进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法
本专利技术属于检测
，更具体的，本专利技术涉及一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法。
技术介绍
水体中的藻类(小球藻)过度繁殖会导致水体中有机质的增加，这些有机质经自来水厂氯化消毒后会产生成百上千种消毒副产物(Disinfectionbyproducts，DBPs)，如氯仿、三氯甲烷和氯乙腈等。目前已有大量关于单种DBPs毒性分析的报道，但氯化藻类有机质(chlorinatedalgaeorganicmatter，Cl-AOM)的制备及毒性研究尚鲜有报道，Cl-AOM经消化系统进入人体，其毒性是其含有的各种DBPs及其它毒性物质综合作用的结果，因此，基于Cl-AOM进行毒性检测具有重要的现实意义。人源细胞由于来源于人体组织，具有良好的代表性，Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，与分化的小肠上皮细胞具有类似的结构和功能，是Cl-AOM毒性分析的首选细胞模型。Caco-2细胞具有细胞色素P450系统，细胞色素P450系统的酶系是人体细胞催化代谢外来物质的主要酶系，能够通过氧化反应消除或减弱部分外来物质的毒性。毒性物质作用于细胞后，会刺激基因mRNA的表达，随之P450蛋白合成增加，表现在酶活的增加。P450系统中的酶能催化7-乙氧基异吩恶唑酮生产异吩恶唑，通过检测异吩恶唑的荧光活性，能反应P450酶的活性，进而检测物质的毒性。目前，已有通过细胞色素P450系统酶活进行毒理学研究的报道，常见的是使用7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶(EROD)活性进行检测。如许友卿等在专利技术专利CN106093332A中公开了利用鱼的EROD检测水体污染的方法，徐镜波等通过鱼肝微粒体EROD活性对9种硝基苯的毒性进行了报道，刘芸等在专利技术专利CN102520154A中公开专利技术了一种通过检测大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞EROD酶活性检测环境中二恶英类物质的方法，江艳艳等(1980)用苯并[α]芘对人胎盘绒毛膜上皮细胞进行诱导，通过EROD活性检测发现细胞色素P4501A1的活性明显增加，陈曦等(2011)用DEHP和B(a)P联合染毒诱导HepG2细胞，发现细胞的CYP1A1在基因、蛋白和酶活性水平均具有一定程度的变化。国内外对于Cl-AOM的相关污染物的毒性常采用动物的EROD实验进行检测。然而，动物的P450酶与相对应的哺乳动物的酶在底物专一性上有很大差别，不能反映出物质的人体毒性情况。此外，EROD实验操作繁琐，结果精确度不高，不同实验存在一定的差别。人源细胞模型是模拟人体、检测毒性的理想模型，但如何选择检测靶点是目前应用细胞模型进行Cl-AOM毒性分析的难点。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：(1)、使用BG11培养基培养小球藻后，离心干燥，得到藻粉；(2)、使用缓冲液溶解藻粉，调节溶液的有机碳含量为40～60mg/L，离心，取上清液过0.45um滤膜；(3)、加入次氯酸钠溶液，于16～37℃氯化1～72h后，氯化后溶液余氯含量为1.80～2.40mgL-1，碱性溶液中和余氯，即得氯化藻类有机质溶液。在其中一些实施例中，步骤(1)中所述离心条件为5000rpm10min，步骤(2)中所述离心条件为8000rpm5min。在其中一些实施例中，步骤(1)中所述干燥为低温冷冻干燥、氮气吹干、真空干燥中的一种或几种，优选为氮气吹干。在其中一些实施例中，步骤(1)中所述有机碳含量是采用TOC-10B、TOC-500、TOC-5000、TOC-V系列、TOC-4100、1270-M、1555B、6800或Lotix-TOC仪器进行测定的，优选采用Lotix-TOC进行测定。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸二氢钠-氢氧化钠、甘氨酸-氢氧化钠，优选为磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH7，0.2MNaH2PO4和0.2MNaOH)。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述有机碳含量为50mg/L。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述氯化后溶液余氯含量为2.0mgL-1。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述碱性溶液为Na2SO3、NaOH、Ca(OH)2中的一种或几种，优选为Na2SO3溶液。在其中一些实施例中，步骤(3)中于20℃氯化24h。本专利技术还提供了上述制备方法制备得到的氯化藻类有机质溶液。本专利技术还提供了氯化藻类有机质的毒性分析方法，包括以下步骤：(1)、将上述氯化藻类有机质溶液溶解DMEM干粉后进行灭菌；(2)、在无菌的氯化藻类有机质溶液中加入FBS、青霉素和链霉素，使其浓度分别为20％v/v、100U/mL和100μg/mL；(3)、将步骤(2)的溶液作用于人源细胞1h，当细胞活力低于80％时，检测P450系统中CYP1A1和CYP1B1基因的表达水平。在其中一些实施例中，步骤(1)中所述灭菌为高压灭菌或无菌滤头过滤灭菌，优选为无菌滤头过滤灭菌。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述人源细胞为caco-2、EC9706、BGC823或SW480，优选为caco-2。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述CYP1A1和CYP1B1基因表达水平采用PCR(聚合酶链式反应)技术进行分析。本专利技术申请人通过基因组学检测方法对Cl-AOM溶液作用caco-2细胞后的总RNA进行分析，发现P450系统中的CYP1A1和CYP1B基因表达明显受到Cl-AOM溶液的影响，表达水平显著增高，是Cl-AOM溶液毒性分析的潜在靶点。因此，通过分析P450系统中CYP1A1和CYP1B基因表达量能一定程度上对外来物质的毒性进行分析。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的氯化藻类有机质(Cl-AOM)溶液是通过先采用氮气吹干的方法获得小球藻藻体，液氮研磨后复溶，保持溶液总有机碳含量为40～60mg/L，氯化，并以碱性溶液进行中和，制备了一种稳定的Cl-AOM溶液，目前尚未见细胞实验用小球藻氯化溶液制备方法的报道；2、氯化藻类有机质(Cl-AOM)溶液中含有大量毒性物质，常用方法是先对各种毒性物质进行检测，然后逐一进行毒性分析，本专利技术的Cl-AOM毒性分析是通过PCR技术检测Cl-AOM暴露caco-2细胞后其P450系统中CYP1A1和CYP1B1的表达量来实现的，其在Cl-AOM混合溶液水平直接进行毒性检测，大大节省了时间，此外，PCR技术能够检测到微量的基因表达差异，具有检测限低、准确度高和灵敏度好的特点，能够对痕量毒性物质引起的基因表达差异进行检测。具体实施方式以下结合具体实施例来详细说明本专利技术。以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。实施例1一种氯化藻类有机质溶液的制备方法本实施例的一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：(1)、使用BG11培养基培养小球藻，于1000勒克斯(lux)光照下进行培养，光照周期为14:10h，当藻生长至对数期后，5000转每分钟离心10分钟，收集小球藻，使用超纯水洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、使用BG11培养基培养小球藻后，离心干燥，得到小球藻藻粉；(2)、使用缓冲液溶解藻粉，调节溶液的有机碳含量为40～60mg/L，离心，取上清液过0.45um滤膜；(3)、加入次氯酸钠溶液，于16～37℃氯化1～72h后，氯化后溶液余氯含量为1.80～2.40mg L

【技术特征摘要】
1.一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、使用BG11培养基培养小球藻后，离心干燥，得到小球藻藻粉；(2)、使用缓冲液溶解藻粉，调节溶液的有机碳含量为40～60mg/L，离心，取上清液过0.45um滤膜；(3)、加入次氯酸钠溶液，于16～37℃氯化1～72h后，氯化后溶液余氯含量为1.80～2.40mgL-1，碱性溶液中和余氯，即得氯化藻类有机质溶液。2.根据权利要求1所述的氯化藻类有机质溶液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述离心条件为5000rpm10min，步骤(2)中所述离心条件为8000rpm5min。3.根据权利要求1所述的氯化藻类有机质溶液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述干燥为低温冷冻干燥、氮气吹干、或真空干燥。4.根据权利要求1所述的氯化藻类有机质溶液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸二氢钠-氢氧化钠、甘氨酸-氢氧化钠中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的氯化藻类有机质溶液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述有机碳含量为50mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁岩，吴彬彬，
申请(专利权)人：广州中国科学院先进技术研究所，中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44