溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白和包含该蛋白质的疫苗制造技术

一种纯化的与分离的核酸分子，该分子包含编码溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白的序列。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的溶血巴斯德氏菌(Pasteurela haemolytica)运铁蛋白结合蛋白，其截短物、类似物、同系物以及同工型；编码该蛋白质和其截短物、类似物和同系物的核酸分子；包含该蛋白质的疫苗；抗该蛋白质的抗体；以及所述蛋白质和核酸分子的用途。巴斯德氏菌属的成员包括一组相关的细菌物种，它们是反刍动物重要的病原体。这组细菌包括基于糖利用已被分类成两种生物型(A和T)的溶血巴斯德氏菌物种，和分类成基于它们的菌体抗原所识别的16种血清型(Biberstein,E.L.等，1960；Fraser等，1982)。以利用海藻糖为特征的溶血巴斯德氏菌的T-型菌株前不久被再分类为新的海藻巴斯德氏菌(P.trehalosi)物种(Sneath,P.H.A等，1990)。由溶血巴斯德氏菌引起的肺巴斯德氏菌病在世界范围内对牛、绵羊和山羊产业是一个主要的经济问题。牛败血病，这一疾病的各种变型在北美的牛产业上是一个主要的问题，并且几乎全部由这一物种的A1型菌株引起(Babiuk,LA.和S.D.Acres,1984)。血清型A2是在绵羊中最主要的致病型，但其它血清型在绵羊和山羊中也可能是重要的(Gilmour和Gilmour,1991)。相关物种海藻巴斯德氏菌(以前称为T-型溶血巴斯德氏菌)是小羊败血症的病原体，该疾病是困扰绵羊产业(特别是在英国)的问题。同样，相关物种多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)物种的菌株引起出血性败血症(在牛和水牛中的一种严重的传染病)，这种病在东南亚特别严重。接种是在反刍动物中控制巴斯德氏菌病的一种合乎需要的方法，但是由于缺乏诱导针对所有致病血清型的保护作用的免疫制剂，其有效性受到限制，特别是在考虑对所有反刍动物有效的疫苗时。杀灭全细胞的疫苗在小牛中引发保护作用不一致的水平和抗体反应(Wilkie,B.N.,1990)，包含水杨酸钠提取物(SSEs)的同种疫苗保护绵羊抵抗由血清型A1,A6和A9引起的疾病(Cilmour等，1983)，但不能抵抗更流行的血清型A2引起的疾病(Fraser等，1982)。由溶血巴斯德氏菌产生的外毒素(其对反刍动物的白细胞和肺泡巨噬细胞特异性致死(Benson等，1978))在小牛和绵羊的保护实验中作为疫苗候选者已显示出很大希望(13,35)，但对抵抗异种血清型具有有限的保护作用(33)。将在铁-有限生长条件下诱导的蛋白质包含进小羊巴斯德氏菌病疫苗中已经显示出增强的保护作用(15)。以前的研究已经说明病原菌体内获取铁的能力是其病理生物学的关键性因素(7,11)。从宿主铁-结合耱蛋白，运铁蛋白取回铁的一种机理涉及通过细菌上的表面受体直接结合运铁蛋白，和从运铁蛋白除去铁并摄取到细胞中(21)。Schryvers(1992)描述了利用亲和层析从各种细菌病原体分离运铁蛋白受体蛋白质的方法。所说的运铁蛋白受体已经显示由两种蛋白质组成，这两种蛋白质称为运铁蛋白结合蛋白1或A(Tbp1或TbpA)和运铁蛋白结合蛋白2或B(Tbp2或TbpB)。铁摄取的受体介导的类型已经显示出在血清型A牛溶血巴斯德氏菌菌株中起作用(26)。在铁有限条件下体外生长的溶血巴斯德氏菌细胞表达大量的可抑制铁的外膜蛋白(IROMPs)，其与由从患巴斯德氏菌病的动物的感染部位体内回收的细胞产生的那些相同(9,10)。在这些蛋白质中尤其突出的是分子大小为100,77,70和60 Kda的那些(9,10)。100 Kda的蛋白质已作为一种牛分离物中的宿主特异性运铁蛋白受体被鉴别(26)，而某些其它IROMPs已被提出为可能与铁获取受体复合物中的100Kda蛋白质相关(26)。由小羊溶血巴斯德氏菌表达的IROMPs在铁获取中的作用还未阐明，也不知道由山羊分离物表达的类似蛋白质。溶血巴斯德氏菌通过受体介导型机制从牛宿主运铁蛋白获得铁。具有这一类型的铁获取机制的细菌可以仅依赖于它们的体内铁获取表面受体(29)的观点意味着它们仅能够引起这些宿主(其运铁蛋白由它们的表面受体识别)中的疾病。已报道溶血巴斯德氏菌引起牛、绵羊和山羊中的疾病，因而预期它们的表面受体会识别这些宿主的运铁蛋白。因此，确定绵羊和山羊分离物是否也具有铁获取中所涉及的运铁蛋白受体以估价它们对不同反刍动物运铁蛋白的特异性，以及确定在引起牛、绵羊和山羊肺巴斯德氏菌病的不同菌株的表面受体之间是否具有抗原相关性是重要的。在牛、绵羊和山羊的各种血清型和生物型(A和T)溶血巴斯德氏菌(和海藻巴斯德氏菌)的收集中鉴别了运铁蛋白受体。生长研究、结合研究和亲和性分离实验显示这些受体具有识别牛、绵羊和山羊运铁蛋白的相同的特异性。这表明在这些受体蛋白质上具有配体结合中所涉及的保守区，其是在细胞表面可及的。抗个体纯化的溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株受体蛋白质(TbpA和TbpB)所制备的抗血清显示出抗选择的代表性菌株的受体蛋白质的相当大的交叉反应性。也观察到抗完整细胞的交叉反应性，说明在细胞表面具有用作宿主免疫作用机制的靶的保守的免疫表位。本专利技术专利技术人已经从溶血巴斯德氏菌A1克隆、测序和表达了编码运铁蛋白受体蛋白TbpA和TbpB(本文也分别称为Tbp1和Tbp2)的tbpA和tbpB基因。这些基因组构在tbpB-tbpA的操纵子排列中。tbpB基因之前是推定的启动子和调节序列，之后为96个碱基对的基因间序列，在其中没有发现任何启动子区，说明这两个基因是协调转录的。TbpA与TbpB蛋白质的推定的氨基酸序列具有与相应的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)Lbp和Tbp蛋白质同源的区。完整的tbpB基因在T7表达系统中表达，并且所形成的重组TbpB蛋白质保持功能性牛运铁蛋白结合特征。重组TbpB的有用性使专利技术人能够说明其对反刍动物运铁蛋白的特异性，其结合牛运铁蛋白的C-和N-端片段两者的能力，以及其对这一蛋白质的载铁形式的优先选择性。本专利技术专利技术人也明显地发现用包含溶血巴斯德氏菌TbpA和TbpB的制剂进行的免疫接种给出很好的抵抗实验性牛肺巴斯德氏菌病的保护作用。用两剂量的TbpB也给出保护作用。广泛而言，本专利技术提供了包含编码TbpA蛋白质的序列的纯化的与分离的核酸分子，或包含编码TbpB蛋白质的序列的纯化的与分离的核酸分子。TbpA与TbpB蛋白质结合反刍动物运铁蛋白，并且在其反刍动物宿主中的溶血巴斯德氏菌的受体介导的铁获取中起作用。TbpA蛋白质大小约100kDa,TbpB大小约60kDa。在本专利技术的一个实施方案中，纯化的与分离的核酸分子包含编码具有如图22或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的TbpA蛋白质的序列，或编码具有如图24或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的TbpB蛋白质的序列。在本专利技术一个优选的实施方案中，纯化的与分离的核酸分子包含编码TbpA蛋白质并且具有如图21或SEQ ID NO:1所示的核酸序列的序列，或编码TbpB蛋白质并且具有如图23或SEQ ID NO:3所示的核酸序列的序列。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：R·Y·C·洛，A·B·施莱维斯，A·A·波特，
申请(专利权)人：R·Y·C·洛，A·B·施莱维斯，A·A·波特，
类型：发明
国别省市：