激活变性蛋白的方法技术

一种从蛋白质和二硫化物成分制备混合二硫化物的方法。其特征在于，失活的几乎不溶形式的蛋白质和足以变性浓度的变性剂溶液在二硫化物组分的存在下一起温孵，溶解，转变为一衍生物。该方法适用于从原核生物中高产率制备变性重组蛋白质。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及增溶和复性变性蛋白，特别是重组生产的变性蛋白的简化方法。当原核细胞如大肠杆菌中产生蛋白质时，经常形成几乎不溶失活蛋白质聚集体(内含体)。为了将这些蛋白转化成活化形式，需要增溶和复性这些蛋白质。这些方法是已知的，例如在EP-A0361475,EP-A0114506,EP-A0093619,EP-A0253823,WO87/02673,EP-A0364926和EP-A0241022中有叙述。激活过程中的一个限制了复性蛋白的产量的重要因素是变性蛋白转换成准确折叠的中间产物和几个蛋白质分子的聚集之间的竞争反应。由于这一原因，复性溶液中复性蛋白质的浓度是复性过程的产量的重要参数。复性蛋白的浓度增加有利于聚集，而具有天然蛋白构型的复性蛋白的相对产量下降(临界浓度)。在大规模的重组蛋白的生产中，待复性的蛋白质的量通常比临界浓度高得多。由于通常蛋白质在使用的激活缓冲液中的溶解度低，所以，产生的值得重视的缺点是产量低，需要时间长，和缓冲液体积大。从WO87/02673了解的一个方法，其中将失活的可溶蛋白用变性剂和还原剂增溶，随后分离还原剂，然后从增溶的蛋白中制备蛋白质和例如谷胱甘肽之间的异源混合的二硫化物。这样混合的二硫化物有利于进一步纯化和复性，因为在硫醇基团(thiolgruppen)修饰后，保护了蛋白质不受空气中氧的氧化，因而在较大的pH范围中是稳定的。净电荷的变化也简化了纯化过程，因为这种变化使非修饰蛋白质可以通过离子交换层析分离。为了形成混合二硫化物，将从还原剂中纯化的，增溶的，透析的，还原蛋白与含有变性剂和用于衍生的二硫化物成分(如，GSSG，胱氨酸，胱胺)的溶液一起温育。在分离二硫化物成分后，以常规方法进行复性。虽然这个过程是有效的，这需要许多个别方法的步骤，特别是在衍生之前除去还原剂。从WO93/19084可以知道一种折叠和纯化胰岛素样生长因子I的方法。根据这一方法，在还原条件下增溶内含体，随后，不经除去还原剂而加入过量的氧化试剂。复性是从随后的稀释(不经透析)和新加入还原剂(为了构建氧化还原系统)开始的。WO91/08762叙述了制备起源于生物活性血小板生长因子的过程。在这一过程中，首先在pH3时，没有还原剂时进行增溶，随后在变性条件下纯化。在这之后，加入氧化剂产生衍生物。根据EP-A0450386，加入增溶缓冲液，随后离心制备内含体(变性的增溶NGF蛋白)提取物。然后用还原剂处理提取物，温育，不经预先透析加入氧化剂氧化。随后，稀释并加入其它成分用于变性。所以，在这一过程中，作为一独立的步骤首先进行增溶不加入氧化还原活性物质。根据US专利号4,933,434，这些方法中，没有一个适于脉冲复性。已知的其它方法使增溶过程可能进行衍生作用。亚硫酸盐裂解法(Sulficolyse)已经长期为人所知(如，Bailey,J.L.,Cole,R.D.,1967，酶学方法，11,206-208；EP0114507)。在这一方法中，用亚硫酸盐处理蛋白质中的二硫桥，作为反应产物，形成50％硫-磺酸盐(RS-SO3-)和50％游离(RS-)蛋白质-SH基团的混合物。然后将游离SH基团经再氧化还原(如用铜离子，iodosobenzoate或优选地连四硫酸盐)转换成二硫化物，通过重复循环这一过程二硫化物可以完全转换成硫代硫酸盐。这一过程相当简单，可以在温和环境条件(如中性pH值)下进行。正如生物化学杂志234,1733已经阐述的，缺点是形成的硫代硫酸盐是化学不稳定的，不可能检测转换的完全程度，并且最主要的是色氨酸残基被再氧化剂部分地破坏了。另一个缺点是难以完全分离含有硫代硫酸盐蛋白质-SH基团和氧化剂如所述的iodosobenzoate的副产物。用分析方法检测这一点是非常费力的。然而为排除已经以非生理方式化学修饰的治疗试剂的可能的副作用，这对于打算用于治疗的蛋白质是绝对需要的。WO95/30686也叙述了用于复性NGF/BDNF家族的神经营养因子的亚硫酸盐裂解法。R.Wetzel等人，基因16(1981)63-71以及W.F.Heath等人，生物化学杂志267(1992)419-425叙述了同样的人胰岛素原的复性过程。已知一类似的方法，该方法避免使用破坏侧链的再氧化条件(Thannhauser,T.W.,Konishi,Y.,Scheraga,H.A.,1984，分析生物化学138,181-188；Thannhauser,T.W.,Scheragea,H.A.,1985，生物化学24,7681-7688)在这种代替再氧化的情况下，当将二硫键还原而得到的半胱氨酸直接通过与2-硝基-5-(磺基硫代)-苯甲酸盐反应进行衍生，在这一过程中释放了2-硝基-5-硫代苯甲酸盐，这可以用分光光度计测量，因此，能够以定量测定转换的SH基团。这一方法的缺点是导入了复杂的化学物质，从最后的产物中完全分离它是非常耗时的，并且难于检测。另外，作者(生物化学24,7681)观察到得到的硫代硫酸盐只有在完全缺乏硫醇基团时是稳定的。另外，在这种情况下(精氨酸脱胺)，也观察到侧链的修饰。本专利技术的目的是为了简化和改进这些方法，和提供稳定的，可储藏的蛋白质，这些蛋白质在其SH基团上被衍生化，并且能够高产量地复性。令人吃惊的是，本专利技术的方法允许在单个步骤中进行增溶和衍生而不必预前还原。特别惊人的是衍生作用也可以发生在酸性条件下(pH值小于7.0，优选地pH3-6.5)，优选地是对神经营养蛋白如NGF，并且，与通常在pH范围7-10与硫醇基团成分的反应比较，该反应基本没有影响反应的动力学和完成程度而进行。通常假设，这样的反应只在存在游离硫酸盐阴离子时进行，这只发生在约7以上的pH值的有效浓度中，因为硫醇盐阴离子的高pK值约为9。所以本专利技术涉及生产由蛋白质和二硫化物成分组成的混合二硫化物的方法，它的特征是在存在二硫化物成分(摩尔比，蛋白质∶二硫化物成分1∶1到1∶10000，优选地1∶1000)时，将失活的几乎不溶形式的蛋白质(内含体)与变性浓度的变性剂的溶液一起温育，增溶和衍生，并且随后除去或不除去二硫化物成分。通过随后如US专利号4,933,434所述进行脉冲复性可以方便地除去二硫化物成分。本专利技术衍生的蛋白质是稳定的，在进一步加工之前可以储藏。这是特别有利的，因为通过本专利技术的方法可以不经过复性产生衍生蛋白。所以，衍生蛋白可以作为分离的中间产物用于多种复性和纯化过程和/或制备。可选择地，在存在还原剂(如，DTT,DTE,GSH，半胱氨酸，胱胺，亚硫酸盐)时进行温育以便衍生蛋白质。这可以提高衍生物产量。在这种情况下，根据实际选择还原剂浓度使二硫化物成分不受限制或只稍微限制是有利的；还原剂浓度高达二硫化物成分的浓度的20摩尔百分比，优选地产生高达10％浓度是有利的。可以加入其它试剂保护游离的SH基团，这是通过重金属，自由基和活化氧种类部分地或完全地防止封阻或破坏这些SH基团。这一类保护剂例如包括EDTA,0.1到100毫摩尔/升浓度或甘露醇，1到1000毫摩尔/升。二硫化物成分被理解为来自二硫化物类的物质如，GSSG，胱胺或半胱氨酸。二硫化物成分在切开二硫键后，能够衍生蛋白质中的SH基团。二硫化物的优选使用浓度是至少1毫摩尔/升或更高，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产由蛋白质和二硫化物成分组成的混合二硫化物的方法，其特征在于，将失活，几乎不溶形式的蛋白质与变性浓度的变性剂的溶液和存在二硫化物成分时温育，溶解和衍生。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A格罗斯曼，
申请(专利权)人：罗赫诊断器材股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]