乳铁蛋白变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及编码铁结合能力改进的乳铁蛋白变体或其部分的重组核酸以及包含所述重组核酸的载体。本发明专利技术还涉及生产这些载体以及含有这些载体的转化细胞的方法。也提供在各种真核或原核细胞中生产乳铁蛋白变体及其部分的方法。最后，本发明专利技术涉及由本发明专利技术核酸编码、用本发明专利技术方法生产的乳铁蛋白及其变体。因此，本发明专利技术提供一种经济有效的生产重组乳铁蛋白变体和其部分的方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
Ⅰ专利
本专利技术总的涉及乳铁蛋白相关的糖蛋白。更具体地，本专利技术涉及乳铁蛋白变体及其部分、它们的生产以及应用。Ⅱ专利技术背景乳铁蛋白是非血红素铁结合糖蛋白中运铁蛋白家族的成员(Aisen等，1980,Ann,Rev.Biochem.49:357-393)，运铁蛋白家族还包括运铁蛋白，血液中主要运输铁的蛋白质(MacGollivray等，1983,J.Biol.Chem.258:3543-3553)；卵运铁蛋白，禽蛋白色蛋白(Jeltesh等，1982,Eur.J.Biochem.122:291-295)；以及黑色素运铁蛋白，该家族的一种膜结合形式见于人体黑色素细胞(Rose等，1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:1261-1265)。乳铁蛋白有很广的分布，它不仅存在于充满机体表面的外部分泌物中(Masson等，1971,Comp.Biochem.Physiol.39:119-129；Hemmart等，1991,Am.J.Clin.Nutr.53:32-39；Masson等，1966,clin.chim.Acta.14:735-739；Pentecost等，1987,J.Biol.Chem.262:10134-10139；Yu等，1993,Biochem.J.296:107-111)，还存在于多形核嗜中性白细胞的二级颗粒中，该颗粒可在嗜中性白细胞激活时释放到血液中(Masson等，1969,J.Exp.Med.130:643-658)。乳铁蛋白的功能包括与铁结合并运输到小肠(Fransson等，1980,J.Pediatrics96:380-384；Iyer等，1993,Eur.J.Clin.Nutr.47:232-241；Cox等，1979,Biochem.Biophys.Acta.558:129-141；Hu等，1988,Biochem.J.249:435-441；Gislason等，1995,J.Pediatr.Gastroent,Nutr.21:37-43；Mikogami等，1994,Am.J.Physiol.267:G1-G8；Ward等，1995,Biotechnology13:498-503)；对各类革兰阴性和革兰阳性细菌有抗微生物活性(Oram等，1968 Biochem.Biophys.Acta.170:351-365；Aronld等，1977,Science197:263-265；Ellison等，1988,Infect.Immun.56:2774-2781；Bellamy等，1992,Biochem.biophys.Acta.1221:130-136；Yamauchi等，1993,Infect.Immun.61:719-728)；促进细胞生长(Hashizume等，1983,Infect.Immun.763:377-382；Nichols等，1987,Pediatr.Res.21:563-567)；调节成髓作用(Sawatzki等，1989,Blood Cells15:371-375；Broxmeyer等，1986,Blood Cells13:31-48；Zucali等，1979,Blood54:951-954)；以及免疫调节性能(Machnicki等，1993,Int.J.Exp.Path.74:433-439；Crouch等，1992,Blood80:235-240；Zagulski等，1989,Br.J.Exp.Pathol.70:697-704)。乳铁蛋白与运铁蛋白家族其它成员有高度的结构同源性。所有这些蛋白质均是分子量约为80kDa的单体糖蛋白。Aisen等，1980,Ann.Rev.Biochem.49:357-393；Metz-Boutique等，1984,Eur.J.Biochem.145:659-676。用X射线晶体学分析已经精确地确定了乳铁蛋白(Anderson等，1989,J.Mol.biol.209:711-734)和运铁蛋白(Lindley等，1988,Biochem.27:5804-5812)的三维结构。蛋白质的氨基和羧基端各一半折叠成球状叶形。该双叶结构的氨基和羧基端各一半之间的保守性约为40％，认为这是由共同的始祖基因的基因内复制而进化成的。Williams等，1982,Trends biochem.Sci.7:394-397。两叶各自可与铁发生高亲和性的可逆结合，并伴随与一个阴离子(通常是碳酸根)结合。Asien等，1980,Ann.Rev.Biochem.49:357-393。乳铁蛋白与铁结合所需的氨基酸在运铁蛋白家族中是高度保守的。Baker等，1992,J.Inorg.Biochem.47:147-160。在乳铁蛋白中，铁原子与氨基端叶结构中的Asp396,Tyr93,Tyr193和His254以及羧基端叶结构中相应的Asp396,Tyr93,Tyr193和His254分别结合。Anderson等，1989,J.Mol.Biol.209:711-734。尽管它们的结构相似，但是乳铁蛋白比其在血清中的对应物运铁蛋白表现出高得多的铁结合亲合性。特别是，乳铁蛋白的铁释放比运铁蛋白表现出更高的pH稳定性，后者在约6-4的pH范围内释放铁，而前者在约4-2的pH范围内释放出铁。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408。曾经提出，乳铁蛋白特有的铁结合性能赋予了该蛋白质一些不同的功能活性。对参与乳铁蛋白特有铁结合性能的结构和功能特性的描述，使我们得以模仿并生成性能改进的乳铁蛋白变体，这些变体包括，但不局限于，对铁有较高的亲和性、抗微生物活性改进的乳铁蛋白变体；对铁亲和性较低、铁释放性能改进的乳铁蛋白变体、或对铁释放的pH依赖性有所修饰的乳铁蛋白变体。本专利技术申请者曾报道过在丝状真菌(包括曲霉属(Aspergillus))中高水平生产重组人乳铁蛋白及其特点。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503；美国专利No.5,571,896,5,571,619和5,571,697，其内容均纳入本文作参考。尽管它有特殊而独特的糖组成，但是该重组蛋白质显示与人乳中乳铁蛋白在生理活性(包括与铁和受体的结合以及抗微生物活性)方面没有区别。因此，现在该表达系统可用来生产足够量的乳铁蛋白变体，以说明该蛋白质的结构/功能，从而生成性能改进的变体。Ⅲ专利技术概述本专利技术涉及编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸序列，其中该部分包括乳铁蛋白至少一个铁结合位点的对应序列。与野生型乳铁蛋白相比乳铁蛋白变体或其部分的还有比改进的铁结合性能进一步得到明确。通过定点诱变，本专利技术解释了两叶结构对乳铁蛋白特有的铁结合性能的作用。使人乳铁蛋白cDNA在该蛋白质一叶或两叶中参与铁结合的两个酪氨酸残基选择性突变，将获得的三个铁结合缺陷型变体在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中表达，并纯化。采用39FeCl3作铁结合分析表明，两叶中任一叶参与铁结合的两个酪氨酸残基的突变将使突变叶选择性地失去铁结合性。另外，pH依赖型铁释放研究证明，乳铁蛋白两叶的铁结合稳定性不同，氨基端叶比羧基端叶更具酸不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸序列，其中所述部分包括乳铁蛋白至少一个铁结合位点的对应序列，且其中乳铁蛋白变体或其部分有改进的铁结合性能。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：OM康尼利，PP沃德，
申请(专利权)人：贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]