转录沉默元件及其结合因子制造技术

包括类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的分离核酸序列。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
根据联邦赞助研究的陈述本专利技术部分由政府基金支持进行，因此政府对所述专利技术具有一定的权利。
技术介绍
本申请涉及核苷酸调节序列及其结合因子。植物进化出一系列各异的保护机制以抵御各种各样的致病生物。引起一系列保守防御反应的受体识别病原体衍生的信号，诸如诱出物(elicitins)、harpins、真菌细胞壁片段、无毒(avr)基因产物及avr基因产物特化的代谢物。这些信号的感受诱导蛋白质磷酸化变化，人们认为这影响了各种各样的防御反应。这样的防御反应包括细胞壁木质化、诱导诸如那些编码壳多糖酶和葡聚糖酶的致病相关(PR)基因、产生抗微生物植物病毒素、诱导系统获得抗病性以及产生参与细胞壁蛋白交联的活性氧类和诱导编程性细胞死亡。这些反应有助于抑制所述植物宿主中病原体的生长和扩散。这些防御反应中的许多依赖于对合适信号反应的特定基因的转录诱导。例如，当病原体攻击或不同的病原体因子诱导(elicit)诸如烟草和土豆的茄科植物时，发生主要的代谢转变，其中抑制固醇产生和诱导倍半萜植物抗毒素合成。倍半萜植物抗毒素生物合成特有的第一步是借助于酶环化类异戊二烯中间体FPP，所述酶从种属上称为倍半萜环化酶。在烟草中，所述倍半萜环化酶5-表-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)产生5-表-马兜铃烯，接着加入两个羟基产生壳体二醇(capsidiol)。所述类异戊二烯生物合成途径的固醇特异支路也从中间体FPP延伸出来。固醇生物合成的衰变与角鲨烯合酶活性的抑制和倍半萜环化酶活性诱导的倍半萜生物合成诱导有关。因为这两种酶处于所述途径中一般认定的分支点的位置上，所以认为所述一种酶的诱导和所述另一种酶的抑制是控制碳流动的一种重要机制，并因此形成最终产物。专利技术概述概括而言，本专利技术描述了包括类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的分离核酸序列的特征。最好是，这个分离核酸序列包括序列5′NTACNNTACN3′(其中N为A、T、G或C)(SEQ ID NO:1)；例如，5′CTACAGTACT3′(SEQ ID NO:2)。在最佳实施方案中，本专利技术的核酸包括5′TCTACAGTACT3′(SEQ ID NO:3)或5′ACTCTACAGTACTC3′(SEQ IDNO:4)序列。在其它最佳方案中，所述类异戊二烯合酶是倍半萜合酶(例如，表-5-马兜铃烯合酶(EAS))。在最佳实施方案中，所述核酸序列来自双子叶植物(例如一种所述茄科植物，诸如烟草)。在其它最佳实施方案中，所述核酸序列来自单子叶植物、裸子植物或松柏类植物。在相关方面，本专利技术描述了包含类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的载体或转基因植物(或其种子或其植物细胞)的特征。一般而言，包含本专利技术沉默元件的载体降低或消除了操作性地连接的核苷酸序列在含有载体的细胞(例如，转基因植物细胞)内的表达。在另一方面，本专利技术描述了减少转基因植物中DNA序列转录的方法。这个方法包括下述步骤(a)提供包含所述类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的核酸的转基因植物细胞，所述调节元件处于减少DNA序列转录的位置并整合到转基因植物细胞的基因组中；及(b)由所述转基因植物细胞培养所述转基因植物。在另一方面，本专利技术描述了与类异戊二烯合酶基因沉默调节元件结合的因子，例如多肽。所述“基因沉默调节元件”是指能够负调节基因产物表达的核酸序列。这种沉默元件起降低或消除所述基因表达的作用。基因沉默调节元件的抑制作用引起所述基因表达的激活，例如本文所述的EAS4基因启动子的转录。一般来说，基因沉默调节元件位于基因的5′区，例如位于所述启动子区。多拷贝的这种基因沉默元件也可以用来降低或消除基因表达。所述“处于减少DNA序列转录的位置”是指沉默调节元件位于减少或消除基因表达的位置，所述基因表达是处于这种调节元件的控制之下。一般来说，这种沉默元件足以赋子细胞或组织特异性基因表达或由外部信号或介质诱导的基因表达的依赖于启动子的可控基因表达；这种元件可能位于基因的5′或3′区。另外，减少或抑制转录的沉默元件的位置与其方向和距转录起始位点的距离都无关。一般来说，本专利技术的沉默元件至少减少基因表达转录10％。与不包含沉默元件的转录调节区相比，优选至少减少所述转录20％，更优选至少减少40％，而最优选至少减少90％。所述“从基因获得”是指调节元件的核苷酸序列是以序列信息为基础，所述序列信息包括天然存在的植物基因(例如烟草的EAS4启动子区)。一旦鉴定出所述沉默调节元件，就可以从自然资源中获得根据本专利技术的沉默调节元件，或者可以按照任何标准方法(例如，通过重组方法或化学合成)制备。所述“类异戊二烯合酶基因”是指编码下述多肽的基因，所述多肽能够催化涉及形成二磷酸烯丙酯底物(例如，二磷酸C10、C15或C20烯丙酯底物)分子内的C-C键产生类异戊二烯产物(例如，单萜、双萜、倍半萜或固醇产物)的反应。这种类异戊二烯合酶基因的例子包括但不限于单萜合酶(例如柠檬烯合酶)、双萜合酶(例如，casbene合酶)及倍半萜合酶(例如，5-表-马兜铃烯合酶、vetispiradiene合酶及杜松烯合酶)，它们分别引起二磷酸香叶酯(GPP)、二磷酸香叶基香叶酯(GGPP)、二磷酸金合欢酯(FPP)的环化。所述“表-5-马兜铃烯合酶”或“EAS”是指能够催化二磷酸反，反-金合欢酯环化形成双环中间体表-5-马兜铃烯的酶。所述“操作性地连接”是指类异戊二烯合酶基因沉默调节元件和植物转录调节区以这样一种方式连接，以便当合适的分子(例如转录蛋白)和所述沉默调节序列结合在一起时，降低或消除基因表达。所述“多肽”是指任何氨基酸链，与长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)无关。所述“转化植物细胞”是指利用重组DNA技术(例如本文所述的那些技术)引入重组核苷酸序列(例如所述EAS4启动子)的细胞(或其祖先)。所述“植物细胞”是指由半透膜定界的并含有质体的任何自身繁殖细胞。如果需要进一步的增殖，这个细胞也需要细胞壁。本文所用的植物细胞包括但不限于藻类、蓝细菌、种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。所述“转基因的”是指包含DNA序列的任何细胞，所述DNA序列由人工插入细胞并成为由该细胞发育的生物基因组的一部分。本文所用的转基因生物一般是转基因植物，并且所述DNA由人工插入到所述生物的基因组中。所述“分离的DNA”是指无下述序列的DNA，所述序列在衍生本专利技术DNA的生物天然存在的基因组中位于所述DNA的侧翼。因此所述术语包括诸如掺入到载体、自主复制型质粒或病毒、或者原核或真核生物基因组DNA中的重组DNA沉默调节元件；或作为独立于其它序列的分离分子(例如在启动子区内)存在的重组DNA沉默调节元件。它也包括作为编码多肽序列的杂种基因部分的重组DNA调节元件。从下述的其最佳实施方案的描述及权利要求书中可明显地看出本专利技术其它的特点和优点。详细描述首先解释附图。附1A是一示意图，显示了所述EAS4启动子区图谱。用小箭头和具有A-E字母符号的线段表示用于克隆和产生不同探针和竞争者的聚合酶链式反应(PCR)引物的位置。在图右侧的大箭头代表所述EAS4的开放读框。带有+1符号的弯曲箭头表示所述EAS4转录起始位点(如SEQ ID NO:5中描述的位置1299(5′G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：J·查普尔，J·D·纽曼，S·H·殷，
申请(专利权)人：肯塔基州州立大学托管委员会，
类型：发明
国别省市：