编码新孢子虫蛋白质的多核苷酸分子制造技术

本发明专利技术提供了包含编码犬新孢子虫ＧＲＡ１、ＧＲＡ２、ＭＩＣ１、ＳＡＧ１和ＭＡＧ１蛋白之核苷酸序列的多核苷酸分子，以及重组载体、被转化的宿主细胞和重组表达的蛋白质。本发明专利技术进一步提供了包含犬新孢子虫的双向ＧＲＡ１／ＭＡＧ１启动子之核苷酸序列的多核苷酸分子。本发明专利技术进一步提供基于本发明专利技术之多核苷酸分子的遗传构建体，该构建体可用来制备被修饰的新孢子虫细胞株系以用于抗新孢子虫病的疫苗中。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物保健领域，并涉及疫苗组合物和疾病诊断方法。具体地说，本专利技术涉及包含编码新孢子虫(Neospora)GRA1,GRA2,SAG1,MIC1和MAG1蛋白质之核苷酸序列的多核苷酸分子，所说的多核苷酸分子和蛋白质可用于生产抗新孢子虫病的疫苗，及作为诊断试剂。新孢子虫是动物的一种病原性原生动物寄生虫，已认定其为哺乳动物流产、新生儿死亡、先天性感染和脑炎病的主要原因(Dubey和Lindsay,1996，兽医寄生虫学，67:1-59；Dubey和Lindsay,1993，今日寄生虫学，9:452-458)。犬新孢子虫(Neospora caninum)会感染犬，并先天性地感染幼犬，常常导致麻痹。已从天然感染的幼犬体内分离出了速殖体(Lindsay和Dubey,1989，寄生虫学杂志，75:163-165)。新孢子虫感染是奶牛和肉牛流产的主要原因。也已报导了绵羊、山羊和马新孢子虫相关疾病即新孢子虫病的病例。虽然犬新孢子虫表面相似于病原体Toxoplasma gondii，但犬新孢子虫和T.gondii彼此在抗原性和超结构上是不同的(Dubey和Lindsay,1993，上述文献)。此外，已显示从流产的牛胎儿脑中分离的、并在体外连续培养的新孢子虫样原生动物寄生虫在抗原性和超结构上都明显不同于T.gondii和Hammondia hammondi，而与犬新孢子虫最为相似(Conrad等，1993，寄生虫学，106:239-249)。再者，对核小亚单位核糖体RNA基因的分析表明，从牛和犬体内分离的新孢子虫株系之间没有核苷酸差异，但新孢子虫和T.gondii之间则显示了一致的差异(Marsh等，1995，寄生虫学杂志，81:530-535)。已证实了新孢子虫的牛分离物在牛流产和先天性疾病中的病原作用(Barr等，1994，兽医诊断与研究杂志，6:207-215)。已使用被犬新孢子虫感染的纯系BALB/c小鼠建立了中枢神经系统新孢子虫病的啮齿动物模型(Lindsay等，1995，寄生虫学杂志，81:313-315)。另外，Cole等人(1995，寄生虫学杂志，81:730-732)和Long等人(1996，寄生虫学杂志，21:608-611)已分别描述了研究妊娠的杂系和纯系小鼠中犬新孢虫跨胎盘传播的模型。已证明了十分相似于天然获得性新孢子虫诱发的牛流产的实验性犬新孢子虫矮山羊模型(Lindsay等，1995，美国兽医研究杂志，56:1176-1180)。也已证明有一种实验性犬新孢子虫绵羊模型十分相似于天然获得性新孢子虫诱发的牛流产(Buxton等，1997,J.Camp.Path.117:1-16)。在T.gondii中，包含抗原的排泄-分泌组的电子致密颗粒存在于速殖体的胞浆中。已将这些抗原定名为GRA蛋白。已报导T.gondii的GRA1蛋白质的分子量为大约22-27KDa，并且T.gondii的GRA2蛋白质的分子量为大约28KDa(Sam-Yellowe,1996，今日寄生虫学，12:308-315)。相似的电子致密颗粒也存在于犬新孢子虫速殖体的胞浆中(Bjerkas等，1994，临床诊断与实验免疫学，1:214-221；Hemphill等，1998，国际寄生虫学杂志，28:429-438)。也已知T.gondii含有一组定名为SAG的主要表面抗原。据报导T.gondii的SAG1蛋白的分子量约为30KDa(Kasper等，1983，免疫学杂志，130:2407-2412)。在组织培养条件下，抗T.gondii SAG1蛋白质的单克隆抗体明显地阻断T.gondii速殖体侵入牛肾细胞的能力(Grimwood和Smith,1996，国际寄生虫学杂志，26:169-173)。由于T.gondii SAG1似乎在侵入过程中发挥某种作用，所以推测SAG1对于支持毒力表型可能是必要的(Windeck和Gross,1996，寄生虫学研究，82:715-719)。与这一推测一致的是，先用T.gondii SAG1免疫、然后用T.gondii攻击的小鼠比对照组小鼠降低了它们的脑中的弓浆虫孢囊形成(Debard等，1996，感染与免疫，64:2158-2166)。T.gondii SAG1可能在功能上与Hemphill等人(1997，寄生虫学，115:371-380)所述的新孢子虫中称为NC-p36的相似分子有关。微丝是位于T.gondii和新孢子虫速殖体顶端的细胞内细胞器，并可在侵入期间的宿主细胞识别和在细胞表面上附着中起作用(Formaux等，1996，微生物学与免疫学当前论题，219:55-58)。已在T.gondii中鉴定了至少4种不同的微丝相关(MIC)蛋白质。T.gondii的MIC1蛋白约60KDa，它与宿主细胞的表面结合，并已报导其与能结合到人肝细胞上的恶性疟原虫中的血小板反应蛋白相关性粘附蛋白(TRAP)有部分同源性。(Robson等，1995,EMBO J.,14:3883-3894)。寄生虫从速殖体转变成慢殖体是T.gondii慢性感染和持久性的关键因素。已在T.gondii中鉴定了表达一种免疫显性的称为MAG1的慢殖体特异性65KD抗原的基因(Parmley等，1994，分子生物化学与寄生虫学，66:283-296)。已报导可在慢殖体孢囊中，而不是在速殖体阶段表达MAG1。这种表达特异性可能表明，MAG1参予寄生虫生命周期中速殖体和慢殖体阶段间的转换(Bohne等，1996，微生物学与免疫学当前论题，219:81-91)。在新孢子虫中鉴定T.gondii GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白的蛋白质同系物，和编码所述新孢子虫蛋白之多核苷酸分子的核苷酸序列，将有利于开发抗新孢子虫病的疫苗，以及诊断试剂。本专利技术提供包含编码犬新孢子虫中GRA1蛋白的核苷酸序列的一种分离的多核苷酸分子。在一优选实施方案中，GRA1蛋白具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，本专利技术分离的编码GRA1的多核苷酸分子包含选自下列一组的核苷酸序列SEQ ID NO:1的从大约nt205至大约nt777的核苷酸序列，存在于SEQ ID NO:3中从大约nt605至大约nt1304的GRA1基因之开放阅读框(ORF)的核苷酸序列，和质粒pRC77(ATCC209685)的编码GRA1的ORF的核苷酸序列。在一非限制性实施方案中，本专利技术分离的编码GRA1的多核苷酸分子包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3之核苷酸序列的核苷酸序列。本专利技术进一步提供具有与本专利技术编码GRA1的多核苷酸分子之核苷酸序列同源的核苷酸序列的一种分离多核苷酸分子。本专利技术进一步提供包含编码与犬新孢子虫GRA1蛋白同源之多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸分子。本专利技术进一步提供由上文提到的任一种GRA1相关性多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列组成的多核苷酸分子。本专利技术进一步提供包含编码犬新孢子虫GRA2蛋白之核苷酸序列的一种分离的多核苷酸分子。在一优选实施方案中，GRA2蛋白具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，本专利技术分离的编码GRA2的多核苷酸分子包含选自下列组中的核苷酸序列S本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含编码新孢子虫ＧＲＡ１蛋白之核苷酸序列的分离的多核苷酸分子，所说的核苷酸序列选自下列成员：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中从大约ｎｔ２０５至大约ｎｔ７７７的开放阅读框（ＯＲＦ）的核苷酸序列，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中从大约ｎｔ６０５至大约ｎｔ１３０４的ＯＲＦ的核苷酸序列，和质粒ｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ２０９６８５）的编码ＧＲＡ１的ＯＲＦ的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DA布雷克，RA玛杜拉，BA杜尔特施，BR克里施南，SC约德，
申请(专利权)人：辉瑞产品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]