一种人类ＥＰＯ受体激动剂多肽，包含修饰过的下面结构式的ＥＰＯ氨基酸序列： ＡｌａＰｒｏＰｒｏＡｒｇＬｅｕＩｌｅＣｙｓＡｓｐＳｅｒＡｒｇＶａｌＬｅｕＧｌｕＡｒｇＴｙｒＬｅｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＬｙｓ １０ ２０ ＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｓｎＩｌｅＴｈｒＴｈｒＧｌｙＣｙｓＡｌａＧｌｕＨｉｓＣｙｓＳｅｒＬｅｕＡｓｎＧｌｕＡｓｎＩｌｅＴｈｒ ３０ ４０ ＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｎＰｈｅＴｙｒＡｌａＴｒｐＬｙｓＡｒｇＭｅｔＧｌｕＶａｌＧｌｙＧｌｎＧｌｎＡｌａ ５０ ６０ ＶａｌＧｌｕＶａｌＴｒｐＧｌｎＧｌｙＬｅｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｕＡｌａＶａｌＬｅｕＡｒｇＧｌｙＧｌｎＡｌａＬｅｕ ７０ ８０ ＬｅｕＶａｌＡｓｎＳｅｒＳｅｒＧｌｎＰｒｏＴｒｐＧｌｕＰｒｏＬｅｕＧｌｎＬｅｕＨｉｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｌａＶａｌＳｅｒ ９０ １００ ＧｌｙＬｅｕＡｒｇＳｅｒＬｅｕＴｈｒＴｈｒＬｅｕＬｅｕＡｒｇＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｌａＧｌｎＬｙｓＧｌｕＡｌａＩｌｅＳｅｒ １１０ １２０ ＰｒｏＰｒｏＡｓｐＡｌａＡｌａＳｅｒＡｌａＡｌａＰｒｏＬｅｕＡｒｇＴｈｒＩｌｅＴｈｒＡｌａＡｓｐＴｈｒＰｈｅＡｒｇＬｙｓ １３０ １４０ ＬｅｕＰｈｅＡｒｇＶａｌＴｙｒＳｅｒＡｓｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇＧｌｙＬｙｓＬｅｕＬｙｓＬｅｕＴｙｒＴｈｒＧｌｙＧｌｕＡｌａ １４０ １６０ ＣｙｓＡｒｇＴｈｒＧｌｙＡｓｐＡｒｇ １６６ 其中Ｎ端的１－６个氨基酸和Ｃ端的１－５个氨基酸可以可任选地从所述ＥＰＯ受体激动剂多肽上缺失。 其中Ｎ端与Ｃ端或是直接地，或是通过一个能连接Ｎ端和Ｃ端的接头相连接，并分别在下列氨基酸上有新的Ｃ和Ｎ端； ２３－２４ ４８－４９ １１１－１１２ ２４－２５ ５０－５１ １１２－１１３ ２５－２６ ５１－５２ １１３－１１４ ２６－２７ ５２－５３ １１４－１１５ ２７－２８ ５３－５４ １１５－１１６ ２８－２９ ５４－５５ １１６－１１７ ２９－３０ ５５－５６ １１７－１１８ ３０－３１ ５６－５７ １１８－１１９ ３１－３２ ５７－５８ １１９－１２０ ３２－３３ ７７－７８ １２０－１２１ ３３－３４ ７８－７９ １２１－１２２ ３４－３５ ７９－８０ １２２－１２３ ３５－３６ ８０－８１ １２３－１２４ ３６－３７ ８１－８２ １２４－１２５ ３７－３８ ８２－８３ １２５－１２６ ３８－３９ ８４－８５ １２６－１２７ ４０－４１ ８５－８６ １２７－１２…。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人类促红细胞生成素(EPO)受体激动剂。这些EPO受体激动剂保留天然EPO的一种或多种活性，还有可能显示出改善的刺激造血细胞的活性和/或改善的活性分布型(profile)，包括与天然EPO有关的不良生物活性的减少，和/或具有改善的物理特性，包括提高了的溶解度、稳定性和重折叠效率。
技术介绍
刺激骨髓细胞分化和/或增殖的集落刺激因子已经引起很大的兴趣，因为它们具有用于恢复降低的造血干细胞衍生细胞水平的治疗潜力。促红细胞生成素是一种天然存在的糖蛋白激素，其分子量最初报道是大约39,000道尔顿(T.Miyaki等人，J.Biol.Chem.252:5558-5564(1997))。成熟的激素长166个氨基酸，而具有前导肽的激素的“前原”形式长193个氨基酸(F.Lin的美国专利第4,703,008号)。按照氨基酸序列计算，成熟激素的分子量为18,399道尔顿(K.Jacobs等人，Nature313:806-810(1985)；J.K.Browne等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.5:1693-702(1986))。通过氨基酸取代和缺失制备的第一批突变促红细胞生成素(即促红细胞生成素类似物)已显示减低或未改善活性。如美国专利4,703,008所述，用苯丙氨酸取代15、40和145位上酪氨酸残基、用组氨酸取代7位上半胱氨酸残基、用天冬酰胺取代2位上脯氨酸、缺失残基2-6、缺失残基163-166和缺失残基27-55，并不导致生物活性的明显提高。Cys到His的突变去除了生物活性。一系列带有对天冬酰胺残基28、38或83的单氨基酸取代的突变促红细胞生成素，显示活性严重降低(24位的取代)，或显示快速的细胞内降解和明显缺乏分泌(对残基38或183的取代)。丝氨酸126上的O-糖基化作用位点的去除，导致促红细胞生成素类似物的快速降解或缺乏分泌(S.Dube等人，J.Biol.Chem.33:17516-17521(1988))。这些作者得到结论残基38、83和126上的糖基化作用位点是正常分泌所必需的，而位于残基24和38的糖基化作用位点与成熟促红细胞生成素的生物活性有关。去糖基化的促红细胞生成素在体外生物测定中具有完全的活性(M.S.Dorsal等人，Endocrinology 116:2293-2299(1985)；美国专利第4,703,008号；E.Tsuda等人，Eur J.Biochem.266:20434-20439(1991))。然而，普遍认为促红细胞生成素的糖基化在激素的体内活性中具有关键作用(P.H.Lowy等人，Nature 185:102-105(1960)；E.Goldwasser和C.K.H..Kung,Ann.N.Y.Acad.Science 149:49-53(1968)；W.A.Lukowsky和R.H..Paiter,Can.J.Biochem.:909-917(1972)；D.W.Briggs等人，Amer.J.Pys.201:1385-1388(1974)；J.C.Schooley,Exp.Hematol.13:994-998；N.Imai等人，Eur.J.Biochem.194:457-462(1990)；M.S.Dordal等人，Endocrinology 116:2293-2299(1985)；E.Tsuda等人，Eur.J.Biochem.188:405-411(1990)；美国专利第4,703,008号；J.K.Brown等人，Cold Spring Harbor Symposia on Quant.Biol.51:693-702(1986)；和K.Yamaguchi等人，J.Biol.Chem.266:20434-20439(1991))。促红细胞生成素的去糖基化类似物体内生物活性的缺乏，被认为是去糖基化的激素从受处理动物的循环中快速清除所致。糖基化和去糖基化的促红细胞生成素在原生质中半衰期的直接比较支持这一观点(J.C.Spivak和B.B.Hoyans,Blood 73:90-99(1989)，和M.N.Fukuda等人，Blood73:84-89(1989))。对促红细胞生成素糖基化位点的寡核苷酸定向诱变，已有效地探索了糖基化作用的功能，但却未能提供深入了解，以了解明显改善激素特性以用于治疗应用的有效策略。已经构建了一系列单氨基酸取代或缺失的突变体，涉及到氨基酸残基15、24、49、76、78、83、143、145、160、162、163、164、165和166。在这些突变体中，促红细胞生成素的羧基末端、糖基化作用位点和酪氨酸残基被改变。已经将所述突变体给予动物，同时监测血红蛋白、血细胞比容和网织红细胞的水平(EP No.0409113)。虽然其中的许多突变体保留了体内生物活性，但与天然促红细胞生成素相比，没有一个显示其提高血红蛋白、血细胞比容和网织红细胞(红细胞的直接前体)的水平的能力有显著提高。已经构建了另一组突变体以探索残基99-119(域1)和残基111-129(域2)的功能(Y.Chem等人，Eur.J.Biochem.202:225-230(1991))。域1突变体在一个体外生物测定中快速降解并且无活性，而域2突变体充其量保留了体外活性。与野生型人类促红细胞生成素相比，这些突变体也不显示增强的体内生物活性。这些作者得到结论残基99-119在促红细胞生成素的结构中具有关键作用。人类促红细胞生成素分子包含两个二硫桥，一个连接7位和161位的半胱氨酸残基，第二个连接29位和33位的半胱氨酸(P.H.Lai等人，J.Biol.Chem.261:3116-3121(1986))。已经使用寡核苷酸定向诱变来探索人类促红细胞生成素中连接29位和33位半胱氨酸的二硫桥的功能。已将33位上的半胱氨酸转换为一个脯氨酸残基，这模拟鼠促红细胞生成素在这个残基上的结构。得到的突变体具有大大降低的体外活性。活性的降低是如此严重，以致作者得出结论残基29和33之间的二硫桥对于促红细胞生成素的功能来说是不可缺少的(F.K.Lin,Molecularand Cellular Aspects of Erythropoietin and Erythropoiesis，第23-26页，I.N.Rich编辑，Springer-Verlag,Berlin(1987))。Lin,F-K的美国专利第4,703,008号(下文称为“008专利”)考虑了EPO的许多种修饰形式，包括EPO的添加、缺失和取代类似物。虽然008专利提到糖基化位点的缺失可能会提高在酵母中产生的EPO的活性(见008专利第37栏(column 37)，第25到28行)，但并未指出任一种建议的修饰形式会在本质上增加生物活性。同时，008专利推测，一个或多个酪氨酸残基被苯丙氨酸取代的EPO类似物，可能显示提高或降低的受体结合亲和力。Fibi,M等人的澳大利亚专利申请第AU-A-59145/90号也讨论了一些修饰的EPO蛋白(EPO突变蛋白)。它一般性地考虑了EPO上10-55、70-85和130-136氨基酸的改变。具体地讲，在羧基末端区添加带正电荷的碱性氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：C·A·麦惠特，Y·Q·冯，N·萨默斯，
申请(专利权)人：G·D·瑟尔公司，
类型：发明
国别省市：
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