油体及结合蛋白质作为亲和基质制造技术

描述了一种从混合物中分离目标分子的方法。该方法使用油体和它们的结合蛋白质作为亲和基质用于所选择性地非共价结合所需的目标分子。油体蛋白可以基因融合至对预期目标分子有特异性的配体上。天然的油体蛋白也可以与油体蛋白特异性配体，例如抗体或油体结合蛋白质一起使用。该方法使得可以根据油体和水溶液密度之间的差异分离和回收所需的目标分子。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用油体及其结合蛋白质作为亲和基质从样品中分离和纯化目标分子。
技术介绍
在生物技术普遍领域内，从复杂的来源(例如活细胞、血清或发酵液)中有效分离和纯化分子的能力非常重要。在工业和科研实验室(在此，例如，要用纯化或部分纯化的蛋白质)中的应用很多，并且已有文献很好证明。参考，例如，R.Meadon和G.Walsh，生物技术进展1994，12635-646页。大部分目前用于分离分子的技术利用了所关心的分子自身的物理和化学性质。基于亲和力的纯化技术的独特性在于它们利用了能形成亲和对的两种分子间的高度特异的生物识别。亲和对中两个个体的结合在几乎所有情况中都是由于比较弱的化学相互作用，称为非共价键。本领域公认和普遍使用的亲和对包括抗体及其抗原结合物、核酸结合蛋白质和核酸、脂质结合蛋白和脂质，植物凝集素和糖类、链霉抗生物素蛋白/生物素复合体、蛋白A/免疫球蛋白G复合体以及受体和它们的结合分子。通常，亲和纯化过程要求亲和对中的一个成分固定在固体底层或基质上，该底层或基质在亲和对中另一个成分所存在的液体中不溶。亲和对中结合在基质上的分子种类通常称为配体，而溶解在液体中的成分通常称为目标成分。但是，注意到这些定义并不是严格化学意义上的限定这一点是很重要的。大部分通用配体固定技术依赖于物理或化学方法。配体固定化物理方法包括配体吸附或俘获到合适的支持物上，而化学固定方式的特点在于在配体和基质间形成强大交联或共价结合。对实现固定化的方式有一个要求，即固定化操作对亲和对成分间相互识别的能力应没有不利影响。现有的配体固定物理和化学技术的缺点之一是常常比较费时、昂贵。这主要是因为固定技术要求分别生产基质材料和配体，并必须在随后的步骤中将它们偶联。美国专利第5474925号公开了一种固定蛋白质的替代方式，该专利阐明了一种用于固定棉花植物纤维中的酶的生物学生产系统。据称，这份专利首次公开了一种生物学方法产生的酶固定系统，能一步生产基质和配体。配体在基质上固定后，可以采用许多基于亲和力的纯化技术，以实现亲和力固定的配体和目标成分间的选择性结合。现有技术已知的基于亲和力的纯化技术包括灌注亲和层析，亲和排阻层析，超扩散亲和层析，亲和沉淀，膜亲和分配，亲和交叉流超滤和亲和沉淀。在最广泛使用的基于亲和力的纯化技术-亲和层析中，含有配体的基质被包裹在或填装在层析柱的内部。然后将含有目标成分的复杂混合物上样到层析柱中。理想地，只有特异识别配体的目标分子以非共价方式结合到层析柱上，而样品中所有其它种类的分子均流过柱子。在亲和分配中，采用两种密度有相当差别的溶液。将含有目标成分的复杂溶液与含有亲和配体的密度不同的溶液混合。混合后，溶液静置以便形成两个分离相。分子将按照大小、电荷和与形成相的溶液的特异相互作用而在两相间有差异地分配。结合配体的目标蛋白质选择性地分配到含有亲和配体的相中。例如，Coughlin和Baclaski在生物技术进展(1990，6307-309)中报导用含生物素的有机溶液异辛烷将抗生物素蛋白从水溶液中转移到异辛烷溶液中。但是，迄今亲和分配的应用一直受到限制，这主要是由于缺少合适的、能用于两相系统中进行特异分配的亲和基质物质。生物技术商业发展的一个重要因素是生物产品的纯化，它通常占总成本的50％或以上(Labrou，N.和Clonis，Y.D.，生物技术杂志3695-119(1994))。许多蛋白质纯化步骤依赖于柱类型分离过程。更具体地说，大规模高度分离技术例如柱层析或成批类型的蛋白质纯化技术花费高。另外，粗样本不太适合进行柱层析或成批分离，因为杂质可能会损坏沉积的树脂并堵塞柱子。因此，经常只在要求较高纯度、蛋白质以极稀浓度存在或需要高价值蛋白质(例如诊断和治疗蛋白质)时，才在纯化方法的较后阶段中应用亲和基质。Labrou，N.和Clonis，Y.D.在生物技术杂志3695-119(1994)综述了这些和其它有关生物技术方法中使用亲和技术的课题。本领域需要开发从复杂混合物中分离和纯化生物产品的新的、经济的方法。本专利技术人已发现，在这方面，可以使用亚细胞油储存结构(称为油体)和它们的结合蛋白质。专利技术概述本专利技术涉及生产亲和基质的一种新型多用途生物系统。本专利技术人发现油体及其结合蛋白质可以作为亲和基质，用来从样品中分离多种目标分子，例如蛋白质、糖类、脂质、有机分子、核酸、金属、细胞和细胞组分。根据本专利技术，提供了一种从样品中分离目标分子的方法，该方法包括1)使能直接或间接结合目标分子的i)油体与ii)含有目标分子的样品接触；和2)从样品中分离结合了目标分子的油体。油体和含有目标分子的样品进行接触的方式能有效保证油体和目标分子结合。优选地，油体与目标混合在一起。如果需要，可以进一步将目标分子与油体分离。一方面，目标分子对油体或油体蛋白有亲和力，或可与其直接结合。这种目标的例子包括抗体或可结合油体的其它蛋白质。另一方面，可以用配体分子将目标分子和油体结合在一起。在一个实施方案中，配体对油体或油体蛋白有天然的亲和力。在一个具体实施方案中，配体是可结合油体蛋白的抗体。这种抗体可以用来分离对配体抗体(例如，抗IgG抗体或蛋白A)有亲和力的目标分子。也可以制备对油体蛋白和目标分子都有结合特异性的二价抗体。也可以将抗油体蛋白的抗体与对目标分子有亲和力的第二配体融合。在另一个实施方案中，配体被共价连接到油体或油体蛋白上。一个实施方案中，配体是经化学方式与油体蛋白缀合的蛋白质，或以与油体蛋白形成的融合蛋白的形式产生的蛋白质(如WO96/21029所述)。后一种情况下，融合蛋白质被靶向并表达于油体上。在一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是水蛭素，可以用来纯化凝血酶。在另一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是金属硫蛋白，可以用来从样品中分离镉。在又一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是蛋白A，可以用来分离免疫球蛋白。在又一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是纤维素结合蛋白质，可以用来从样品中分离纤维素。另一个实施方案中，配体可以与油体共价结合。例如，配体可以是小的有机分子象生物素。生物素化的油体可以用来从样品中分离抗生物素蛋白。本专利技术还包括可用做亲和基质的改性油体。相应地，本专利技术包括一种组合物，它包含结合了例如配体分子或目标分子之类分子的油体。一个实施方案中，该组合物包含共价结合了配体分子(如生物素)的油体。本专利技术还包括用于从样品中分离目标分子的亲和基质，其中包含能结合目标分子的油体。亲和基质另外可以包括与油体结合的配体分子，其中的配体分子能结合目标分子。根据以下的详细叙述和附图，本专利技术其它主题、特性和优点是显而易见的。但应该明白，专利技术详述和相关的实施例仅是举例说明，落在本专利技术范围内的另外的各种变化和修饰对本领域技术人员是显然的。另外，各种出版物、专利和专利申请在此全文引做参考文献。附图简述附图说明图1拟南芥(Arabidopsis thaliana)18KD油质蛋白的核苷酸序列和推知的氨基酸序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。图2拟南芥油质蛋白-水蛭素融合蛋白序列。图示是部分油质蛋白基因组序列(碱基1-1620如Van Rooijen等1992，植物分子生物学181177-1179的报导)，间隔序列(碱基1621本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从样品中分离目标分子的方法，包含：１）将（ｉ）油体与（ｉｉ）含有目标分子的样品接触，以使目标分子结合至油体上；和２）从样品中分离结合了目标分子的油体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：M毛勒尼，J布斯，G范路易简，
申请(专利权)人：塞姆柏奥希斯遗传学公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]